三亚市汉族和黎族女性MTHFR与MTRR基因多态性分布特征

吴利 陈少金 李周扬 陈谦 黎元莉

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（methionine synthase reductase，MTRR）是叶酸代谢途径中的关键酶，MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点多态性可使其相应酶活性降低，在同型半胱氨酸转变为甲硫氨酸的过程中出现障碍，造成叶酸水平降低及血浆中同型半胱氨酸浓度升高［1-2］。而同型半胱氨酸水平的升高可使新生儿神经管缺陷、唇腭裂、先心病及孕产妇妊娠高血压、贫血、自发性流产等疾病发生风险增加［3-4］。MTHFR与MTRR基因多态性存在地区及民族的分布差异，目前尚未见三亚地区关于叶酸利用能力的大样本研究报道。本文对三亚市汉族和黎族女性MTHFR与MTRR基因多态性进行分析，并与国内其他民族进行对比，旨在阐明本地区人群的遗传特征，为出生病因学研究及基于遗传特征的个体化治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

根据知情同意原则，选择2014年10月至2018年7月在三亚市人民医院进行孕前或孕期检查的汉族女性1 590例，年龄（27.55±4.79）岁；黎族女性420例，年龄（26.65±4.67）岁。排除非本地区户籍以及DNA抽提不符合要求的人群，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器及试剂

MTHFR C677T、A1298C位点和MTRR A66G位点的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）分型采用Taqman-MGB技术测定。仪器：低温离心机Beckman J-6BABI、ABI 7900型荧光定量PCR仪；试剂：Buffer A、Buffer B、饱和酚、氯化钠及异丙醇等。相关仪器、试剂均使用美国Applied Biosystems（AB）公司产品。

1.3 基因分型

采集口腔黏膜上皮细胞，采用硅胶吸附法提取基因组DNA。采用荧光定量PCR技术检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点SNP。PCR 反应体系为 10 μL，包含 1 μL 基因组DNA（20 ng/μL），5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB 探针（表1），3.5 μL 去离子水。反应条件：95℃预变性10 min；92℃变性15 s，60℃延伸 1 min，20个循环；89℃变性 15 s，60℃延伸90 s，30个循环。反应完成后，在ABI 7900型荧光定量PCR仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各个样本的基因分型结果。

表1 Taqman-MGB探针所在位置Table 1 Taqman-MGB probe location

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计学分析，采用Haplo-View 4.2进行Hardy-Weinberg平衡、LD水平及单倍型结构分析。计数资料采用百分率表示，对基因型及等位基因频率进行χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析

对三亚市1 590例汉族和420例黎族女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点的检测数据进行Hardy-Weinberg平衡检验。其中，汉族女性MTHFR C677T位点不符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=14.83，P＜0.05），不具有本地区代表性，后文不予分析；黎族女性的MTHFR C677T位点及汉族和黎族女性的MTHFR A1298C与MTRRA66G位点检验结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P＞0.05），具三亚地区群体代表性。

2.2 三亚黎族女性与不同民族女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因频率分布比较

三亚黎族女性MTHFR C677T位点基因型分布及等位基因频率与思南苗族［5］、延边朝鲜族［6］、南宁壮族［7］、乌苏哈萨克族［8］、银川回族［9］、新疆维吾尔族［10］、张家界土家族［11］相比均有显著性差异（P＜0.05）。三亚黎族女性MTHFR A1298C位点基因型分布及等位基因频率与南宁壮族［7］、乌苏哈萨克族［8］、新疆维吾尔族［10］相比无显著性差异（P＞0.05），与文中其他民族相比有显著性差异（P＜0.05）。三亚黎族女性MTRR A66G位点基因型分布及等位基因频率与乌苏哈萨克族［8］和新疆维吾尔族［10］相比无显著差异（P＞0.05），与文中其他民族相比有显著性差异（P＜0.05）（表2、3）。

2.3 MTHFR C677T和A1298C两位点连锁情况及单倍型分析

三亚市黎族女性MTHFR C677T和A1298C两位点组合情况见表4。单倍型结构分析结果显示存在3种组合AC（56.1%）、CC（30.6%）、AT（13.3%）。两位点存在连锁不平衡现象（D'=1.00，r2=0.07）。

表2 三亚黎族与不同民族女性MTHFR、MTRR基因型频数与频率［n（%）］Table 2 Comparison of MTHFR and MTRR genotype distribution and frequencies between the Li women in Sanya and other different nations［n（%）］

表3 三亚黎族与不同民族女性MTHFR、MTRR等位基因频数与频率［n（%）］Table 3 Comparison of MTHFR and MTRR allele frequencies between the Li women in Sanya and other different nations［n（%）］

表4 MTHFR C677T和A1298C连锁型分布［n（%）］Table 4 Distribution of linkage between MTHFR C677T and A1298C［n（%）］

3 讨论

叶酸是一种水溶性维生素，在生物体内以四氢叶酸的形式发挥作用，四氢叶酸是细胞生化反应中甲基的主要供应者，参与嘌呤及嘧啶的合成及同型半胱氨酸的代谢［12］。叶酸缺乏可引起5-甲基四氢叶酸水平下降，从而使S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）水平下降，最终导致DNA低甲基化。此外，低叶酸水平还可使尿嘧啶错误掺入DNA，使DNA链断裂增加，并可导致DNA在复制过程中错误发生率增加，影响DNA的生物合成。体内叶酸水平由叶酸摄入量和叶酸代谢水平决定，正常的叶酸水平对于正常胚胎生长和发育是必不可少的［13］。现已有研究表明，叶酸代谢障碍与唇腭裂、先天愚型、心脏畸形、多发畸形、泌尿系统畸形、肢体畸形、妊娠期贫血、妊娠期高血压的发生具有相关性［14］。叶酸缺乏在我国汉族女性中的发生率极高，远高于欧美国家。

叶酸代谢过程是一个涉及包括5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、甲硫氨酸合成酶（MTR）、甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）和胱硫醚-β-合酶（CBS）等多种酶参与的过程，其中MTHFR和MTRR是叶酸代谢过程中发挥重要作用且突变率较高的关键酶［13］。在叶酸代谢过程中，MTHFR是叶酸活化的核心酶，也是同型半胱氨酸代谢和甲硫氨酸合成的关键酶，其不可逆地催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸。而MTRR是参与同型半胱氨酸代谢的关键酶，其通过催化还原维生素B12（甲基钴胺素）甲基化状态而维持MTR的活性，是平衡同型半胱氨酸水平的关键因素。相关研究已证实，MTHFR和MTRR基因位点多态性均可引起酶活性降低，从而影响叶酸代谢，造成同型半胱氨酸的堆积，增加出生缺陷发生的风险［15］。本研究针对三亚市黎族和汉族女性中MTHFR最常见的突变位点MTHFR C677T和A1298C，以及MTRR最常见的突变位点MTRR A66G这3个基因位点的多态性进行检测分析，以阐明本地区不同民族人群的遗传特征，了解其与国内其他民族基因多态性分布的差异，为下一步有针对性的进行出生缺陷干预奠定基础。

本研究结果显示，三亚黎族女性的MTHFR C677T位点基因型分布及等位基因频率与思南苗族［5］、延边朝鲜族［6］、南宁壮族［7］、乌苏哈萨克族［8］、银川回族［9］、新疆维吾尔族［10］、张家界土家族［11］相比均有显著性差异（P＜0.05），表明该位点的多态性分布存在民族差异。除去乌苏哈萨克族和新疆维吾尔族，本文列举的其他少数民族符合从北到南T等位基因频率逐渐递减的趋势（最高为银川51.80%，最低为三亚13.33%），与汉族的地域分布规律相似［16］，该位点的多态性分布存在地域差异。三亚市黎族与汉族女性的MTHFR A1298C和MTRR A66G位点多态性存在显著性差异（P＜0.05），说明这2个位点在相同地区的不同民族间存在差异，该差异与地域分布无关。三亚黎族女性MTHFR A1298C位点基因型分布及等位基因频率除与南宁壮族［7］、乌苏哈萨克族［8］、新疆维吾尔族［10］相比无显著性差异（P＞0.05），与文中列举的其他民族相比均有显著性差异（P＜0.05）。除去乌苏哈萨克族和新疆维吾尔族，本文列举的其他少数民族符合从北到南C等位基因频率逐渐递增的趋势（最高为三亚30.60%，最低为延边18.20%），该位点的多态性分布存在一定的地域差异，但差异性没有MTHFR C677T位点的强。三亚黎族女性MTRR A66G位点基因型分布及等位基因频率除与乌苏哈萨克族［8］和新疆维吾尔族［10］相比无显著差异（P＞0.05），与文中列举其他民族相比均有显著性差异（P＜0.05）。表明MTHFR A1298C和MTRR A66G位点的多态性分布存在民族差异，但其民族特异性可能没有MTHFR C677T位点强。MTHFR C677T和MTHFR A1298C位点多态性的分布存在地域差异，MTRR A66G位点的多态性分布未发现有地域差异。

我国汉族人群MTHFR C677T位点的多态性具有地域性差异，T等位基因频率呈现北高南低的趋势，MTHFR A1298C和MTRR A66G位点多态性的地域差异相对来说比较不明显［16］。而三亚市汉族人口来源驳杂，祖籍本地的汉族居民所占比例较少，这可能是造成MTHFR C677T位点不符合Hardy-Weinberg平衡的原因。

本研究对三亚黎族女性的MTHFR C677T和A1298C两位点均进行了单倍型连锁不平衡研究。MTHFR C677T位点位于第一号染色体MTHFR基因第5个外显子上，物理位置为11796321 bp。MTHFR A1298C位点位于第一号染色体MTHFR基因第8个外显子上，物理位置为11794419 bp。理论上，连锁不平衡性随着遗传距离的增加而下降，通过分析，D'=1.00，表明两位点间存在连锁关系，r2=0.07，表明两位点间的连锁强度不高。三亚黎族女性的MTHFR C677T和A1298C两位点间存在连锁平衡，但连锁强度不高，可能发生了基因重组等情况。

目前孕期保健措施为育龄妇女从孕前3个月至妊娠满3个月每日补服叶酸，根据不同的生育史、家族史等情况服用不同剂量［17］。而叶酸代谢障碍的人群，对叶酸的利用率较低。通过遗传筛查，可针对存在叶酸代谢障碍的人群采取增加营养素补充，加强监测等等干预措施，达到出生缺陷一级预防的目的，以达到预防出生缺陷儿出生和提高人口素质的目的。