赤羽病病毒Gc405aa—480aa肽段的高效可溶性表达及抗原性鉴定

王建华，张俊哲，赵 丹，王玉玲，肖 妍

（天津海关，天津 300456）

赤羽病是危害牛、羊等反刍动物繁殖性能的重要虫媒疫病，以流产、早产，产死胎、木乃伊胎，以及胎儿畸形，新生胎儿发生关节弯曲积水性无脑综合症（简称AH综合征）为特征，主要流行于澳大利亚以及东南亚、东亚、中东和非洲等热带和亚热带地区[1-4]，给流行地区的牛、羊养殖业造成一定经济损失。自20世纪90年代以来，我国上海和新疆等地也有本病的报道[5-6]，因此该病对我国牛、羊养殖业的威胁不容忽视。在分类上，赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）属于布尼病毒科（Buny aviridae）布尼病毒属（Orthobunyavirus）辛布（Simbu）病毒血清群成员，为单股负链RNA 病毒。AKAV基因组由大（L）、中（M）、小（S）3个RNA 片段构成，其中M RNA 编码1个由1 401个氨基酸组成的M蛋白前体。该前体进一步裂解为Gn和Gc囊膜糖蛋白和1个非结构Nsm蛋白[7-8]。研究证实，G1蛋白为AKAV的一种由936个氨基酸残基组成的囊膜蛋白，相对分子质量为120 kD，存在多个抗原表位区。该蛋白不仅参与病毒粒子对宿主细胞的侵入、装配和成熟过程，也可刺激机体产生中和抗体[9-10]，在赤羽病诊断试剂和疫苗研制方面具有潜在应用价值。为此，本研究对Gc405aa—480aa肽段编码序列，经密码子优化后进行基因合成，利用大肠杆菌原核表达系统成功实现了Gc405aa—480aa肽段的高效可溶性表达，并对该重组肽段进行了纯化和抗原性鉴定，以期为后续开展Gc蛋白单克隆抗体制备、B细胞表位鉴定和诊断试剂研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、参考血清和主要试剂

宿主菌E.coli. BL21（DE3）、山羊抗AKAV阳性血清：由天津海关动植物与食品检测中心反刍动物检疫实验室保存；HRP标记的兔抗山羊二抗：购自JACKSON 公司；氨苄青霉素、IPTG和Ni-NTA Agarose：购置于GIAGEN公司；BugBuster®Master Mix和 Immobilon-PSQPVDF膜：购自MERCK公司；QuickblokTM封闭液、洗涤液和DAB显色试剂盒：购自碧云天生物技术公司。

1.2 Gc405aa—480aa肽段抗原表位区预测及原核表达载体构建

使用IEDB 数据库（Immune epitope database）中的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0软件，对AKAV KM-1/Br/06毒株M基因编码的Gc蛋白（GenBank：BAG54921.1）线性抗原表位进行在线分析，对Gc蛋白的1个75氨基酸肽段（405aa—480aa）的编码序列，送由上海捷瑞生物技术公司经密码子优化后进行人工合成，通过BamHI/SalI位点，连接到原核表达载体PET-32a，构建重组表达载体PET-Gc405aa—480aa，再通过测序结果验证表达序列是否正确。

1.3 重组rHis-Gc405aa—480aa肽段的诱导表达

将重组表达载体PET-Gc405aa—480aa转化的E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行扩大培养，按1%接种量接种于新鲜LB培养基中。当菌液OD600约为0.5时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，在28 ℃、200 r/min振摇条件下继续培养8 h，离心收集菌体；按5 mL/g比例，将湿菌加入细菌裂解液BugBuster®Master Mix，混匀，作用10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min；分别收集菌体裂解液、上清和沉淀，加入等量2×Loading Buffer，沸水水浴5 min；按常规方法进行SDS-PAGE，分析重组肽段的表达情况。

1.4 重组rHis-Gc405aa—480aa肽段的大量表达及纯化

将1 L新鲜LB培养液，按1.3条件诱导培养重组菌后，6 000 r/min 离心5 min，收集菌体；用0.1 mol/L、pH7.5 的PBS液洗涤菌体1次，6 000 r/min 离心5 min，收集菌体；按5 mL/g，将湿菌加入细菌裂解液BugBuster®Master Mix，混匀，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，然后收集裂解液上清。将裂解液上清移入装有Ni+-NTA树脂的重力柱，在冰浴条件下结合1 h；依次用20、60和80 mmol/L咪唑浓度的洗涤液各洗涤2次，每次10 min，最后用300 mmol/L咪唑浓度的洗脱液洗脱。将洗脱液装入透析袋中，用透析液（pH8.0、50 mmol/L 的 Tris-HCl）4 ℃透析过夜，收集的透析液即为纯化的重组rHis-Gc405aa—480aa肽段。用IMPLEN超微量分光光度计，测定重组rHis-Gc405aa—480aa肽段浓度，再用SDSPAGE分析纯化后的重组肽段纯度。

1.5 重组rHis-Gc405aa—480aa肽段的抗原性鉴定

将 纯 化 的 重 组 rHis-Gc405aa—480aa肽 段， 经SDS-PAGE胶电泳分离后，转移至PVDF 膜上，用QuickblokTM封闭液封闭过夜；用洗涤液洗涤3次后，加入1:50稀释的山羊抗AKAV阳性血清，37 ℃ 孵育1 h，再用洗涤液洗涤3次，每次5 min；加入1:5 000稀释的HRP标记兔抗山羊二抗IgG，37 ℃ 孵育1 h，用洗涤液洗涤3次，每次5 min；使用DAB试剂盒显色，拍照。

2 结果

2.1 Gc405aa—480aa肽段预测及重组表达载体构建

使用IEDB 数据库对AKAV Gc蛋白（GenBank：BAG54921.1）进行在线预测分析，预测1个由75氨基酸组成肽段（405aa—480aa）的抗原性及亲水性，结果见图1。在图1-A中，纵坐标数值代表对应横坐标位置的氨基酸抗原性数值，以0.5为阈值，数值越高表示该置的氨基酸抗原性越强，黄色区域为该肽段预测存在抗原表位的区域。图1-B为该肽段亲水性预测结果，其中黄色区域为亲水区，绿色区域为疏水区。对Gc405aa—480aa肽段的编码序列，经密码子优化后进行DNA片段合成，构建重组表达载体PET-Gc405aa—480aa，经测序证实该DNA合成片段的碱基序列及编码的氨基酸序列完全正确（图2）。

图1 Gc405aa—480aa肽段的抗原性和亲水性预测结果

图2 人工合成的DNA序列及编码的氨基酸序列

2.2 重组Gc405aa-480aa肽段的诱导表达及纯化

SDS-PAGE显 示， 在28℃、0.1 mmol/L的IPTG中诱导8 h后，PET-Gc405aa—480aa重组菌的裂解液在26 kD处出现1条蛋白条带，与预期重组肽段蛋白分子质量一致，而未诱导的重组表达菌裂解液中缺失此蛋白条带，凝胶图像分析表明该重组肽段的表达量占菌体总蛋白的50%（图3）。进一步分析显示，重组Gc405aa—480aa肽段完全存在于诱导表达菌的裂解液上清中，表明该重组肽段完全以可溶性形式表达。对含有重组Gc405aa—480aa肽段的上清液用Ni+-NTA树脂进行亲和层析纯化，依次用60、80 mmoL/L咪唑浓度的洗涤液洗涤，发现取得的纯化效果最好，纯化后的重组Gc405aa—480aa肽段纯度为94%，质量浓度为2.0 mg/mL（图3）。

图3 重组Gc405aa—480aa肽段的表达和纯化的SDS-PAGE分析

2.3 重组Gc405aa—480aa肽段的Western blot鉴定

以山羊抗AKAV阳性血清，对纯化的重组Gc405aa—480aa肽段进行Western blotting分析检测，发现在26 kD处出现1条清晰的特异性反应条带（图4），表明该重组肽段可被山羊抗AKAV阳性血清识别，具有良好的反应原性。

3 讨论

赤羽病是危害牛、羊等反刍动物健康和生产性能的重要疫病，而高质量诊断试剂可为赤羽病的诊断、检疫和防控工作提供技术支撑。众所周知，诊断抗原的抗原性和纯度是制约ELISA方法敏感性和特异性的重要因素。研究发现，辛布病毒群的S基因节段序列同源性很高，其编码的N蛋白是群特异性抗原[11]。因此，无论是使用AKAV全病毒抗原，还是使用重组N蛋白抗原建立的ELISA检测方法，均存在与同群其他病毒感染抗体发生交叉反应的不足。然而，辛布病毒群M基因节段的序列变异性较大，其编码Gc蛋白的氨基酸序列同源性仅为33.1%～47.3%，而Gc蛋白在AKAV各分离株之间的同源性却很高[12-14]，这提示选用Gc蛋白为检测抗原可能是提高AKAV血清抗体ELISA检测方法特异性的有效途径。

图4 重组Gc405aa—480aa肽段的Western blot分析

利用原核表达系统表达外源蛋白具有表达量高、生产周期短和成本低的优点，但用该表达系统表达大分子质量的GC蛋白比较困难，需要对多个GC蛋白的强抗原区进行截短筛选表达及抗原性鉴定。目前国内仅有徐树兰等[15]对Gc蛋白156aa—476aa区域进行了截短表达及抗原性鉴定，但该重组蛋白是以包涵体形式表达的。本研究对Gc405aa—480aa肽段编码序列经密码子优化后进行基因合成，构建重组原核表达载体PETGc405aa—480aa，实现了重组 rHis-Gc405aa—480aa肽段在大肠杆菌中的高效可溶性表达。在纯化重组rHis-Gc405aa—480aa肽段的方法上，本研究采用细菌裂解液BugBuster®Master Mix替代超声波破碎菌体，因而减少了对目的蛋白的损伤；通过对洗涤液最适咪唑浓度的确定，获得了大量高纯度的重组rHis-Gc405aa—480aa肽段。Western blotting显示，重组rHis-Gc405aa—480aa肽段对AKAV阳性血清呈现良好的反应原性，表明该重组肽段在AKAV单克隆抗体制备、B细胞表位鉴定以及血清抗体ELISA检测试剂盒研发方面具有良好的应用前景。