H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用

蒋文明，李 阳，程善菊，刘华雷

（中国动物卫生与流行病学中心，国家禽流感专业实验室，山东青岛 266032）

1996年，我国首次从广东省鹅体内分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[1]。从2003年末开始，H5N1亚型禽流感疫情在东南亚多个国家的家禽中暴发，包括越南、泰国、韩国、日本、柬埔寨和印度尼西亚。2004—2015年，我国多个省份暴发H5N1亚型高致病性禽流感疫情，导致超过2 000万只禽类被扑杀，给养禽业造成巨大经济损失。2005年底，我国针对H5亚型AIV开始实行大规模强制免疫政策，并有效控制了疫情。实践证明，在禽流感防控方面，疫苗免疫发挥了巨大作用[2]。但是不可否认，疫苗免疫也带来了一系列问题，如加快了病毒变异速度，使得疫苗必须进行相应更新换代[3]。我国使用的禽流感疫苗从最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12一直在不断更新。病毒变异是由于其血凝素（Hemagglutinin，HA）基因中核苷酸变异引起的。而核苷酸的加速变异会导致以HA基因为靶基因检测方法特异性、敏感性的下降，出现假阴性结果。

现行检测方法中，行业标准《禽流感病毒RTPCR检测方法》（NY/T 772—2013）采用的是普通RT-PCR方法。该方法检测耗时长，需电泳后判定结果，容易造成环境核酸污染。国家标准《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》（GB/T 19438.2—2004）因制定时间太久，可能已不能满足临床病毒变异检测需求。本研究比对了近年来分离到的H5亚型HPAIV HA基因核苷酸序列，在其保守区设计1对引物和1条探针，建立了H5亚型HPAIV实时荧光RT-PCR方法，并进一步验证了该方法的特异性和敏感性，同时与临床上常使用的两种试剂盒进行对比，以期为该病的快速检测、诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒

30株 H5亚 型 HPAIV（5株 H5N1、5株H5N2、15株H5N6、5株H5N8），H7N9、H9N2等亚型AIV，以及新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒：均由本实验室分离保存。

1.2 试剂盒

QIAamp Viral RNA Mini Kit：购自 Qiagen 公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit：购自Vazyme公司；TOPO载体克隆试剂盒：购自CloneSmarter公司；禽流感（AIV-H5）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒：购自深圳匹基生物工程股份有限公司（批号20180302）；禽流感病毒H5亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒：购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司（批号AIVH5 20180702P）。

1.3 引物设计

根据近年来GenBank数据库中公布的H5亚型AIV基因序列以及本室分离的H5亚型AIV序列，针对HA基因序列保守区，设计1对引物及1条探针（专利申请中，序列待公开）。探针5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。

1.4 实时荧光RT-PCR方法建立

根据QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明，提取H5亚型病毒RNA。在反应体系中依此加入2×qRT-PCR Buffer 10.0 μL，引物、探针各 1.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA模板 6 μL。RT-PCR反应条件为：50 ℃10 min，95 ℃ 2 min，然后进行40个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，收集荧光信号）。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，经胶回收后连接TOPO载体，然后进行测序。

1.5 实时荧光RT-PCR方法优化

对反应体系中的不同引物和探针浓度组合（ 引 物 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L， 探 针1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）以及反应体积（50、20 μL）和扩增时反应参数（反转录5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等条件进行摸索和优化，以达到最优组合。

1.6 敏感性试验

提取病毒RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍倍比稀释，取6.0 μL稀释后的RNA模板，加入到14.0 μL qRT-PCR预混液中，然后采用建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其灵敏度。

1.7 特异性试验

利用优化的实时荧光RT-PCR方法，分别检测H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2， 以及新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒等常见禽类病毒，检验该方法的特异性。

1.8 与临床同类试剂盒比较

以10倍倍比稀释的RNA为模板，对比本研究建立的方法与H5亚型AIV核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）、H5亚型AIV实时荧光RT-PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）的敏感性。以实验室分离测序确定的H5病毒RNA为模板，对比该方法与两种试剂盒的特异性。

1.9 临床应用

利用建立的实时荧光RT-PCR方法，对临床发病家禽的10份组织病料进行检测，检验该方法的准确性。

2 结果

2.1 实时荧光RT-PCR方法的建立及优化

为验证实时荧光RT-PCR引物探针的设计，选取实验室保存的H5N6亚型AIV进行荧光RTPCR检测，结果在实时荧光RT-PCR方法中，H5引物探针能够有效检出H5N6亚型AIV，检测结果见图1。

图1 H5亚型AIV实时荧光RT-PCR引物探针验证结果

为进一步说明反应的特异性和准确性，将荧光RT-PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳和测序验证，结果在约120 bp处看到1条特异性扩增条带（图2）；将扩增产物胶回收后连接TOPO载体测序，证实该扩增产物为H5亚型HA基因序列，表明本研究设计的H5亚型引物特异性强，荧光RT-PCR方法特异、准确。

图2 H5亚型AIV实时荧光RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果

在实时荧光RT-PCR体系中，通过对反应体系中不同引物和探针浓度组合、反应体积、扩增时反应参数和循环次数等条件的摸索和优化，建立了检测H5亚型AIV的实时荧光RT-PCR方法，经过反复优化和验证，确定实时荧光RTPCR检测方法的最适反应总体积为50 μL（其中模板6 μL），最适引物浓度均为0.4 μmol/L，探针浓度均为0.3 μmol/L。实时荧光RT-PCR最佳反应条件和循环参数为：第1阶段，反转录50 ℃ 10 min；第2阶段，预变性95 ℃ 2 min；第3 阶段，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。在第3阶段每次循环的退火延伸时，收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

2.2 实时荧光RT-PCR方法的特异性

利用建立的实时RT-PCR方法，分别对H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2 等亚型AIV，以及新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒进行检测，发现该方法只能扩增H5亚型AIV，对其他亚型AIV及其他禽病病毒扩增均为阴性（图3），表明该方法具有良好的特异性。

2.3 实时荧光RT-PCR方法的敏感性

先测定病毒RNA浓度，然后将提取的RNA依次作10倍比稀释，每个稀释度取6 μL作为模板进行检测。结果显示，该方法可以检测到0.1 fg（10-6稀释）的RNA模板（图4）。

图3 实时荧光RT-PCR方法的特异性试验结果

图4 实时荧光RT-PCR方法的敏感性试验结果

2.4 与其他试剂盒的对比

以实验室分离测序确定的30份H5病毒RNA为模板，对比该方法与两种试剂盒的特异性。结果显示，本研究建立的方法可以将30份H5病毒全部检出，检出率为100%。H5亚型AIV核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5亚型AIV实时荧光RT-PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）各有1份检测为阴性，检出率均为98%。

将1.6中的RNA依次作10倍倍比稀释，每个稀释度取6 μL为模板，分别用两种商品化H5亚型AIV荧光RT-PCR试剂盒与本研究建立的方法进行比较。结果显示，本研究建立方法的灵敏度均比这两种试剂盒提高了10倍（图5），说明该方法具有良好的敏感性。

图5 两种商品化H5亚型AIV荧光RT-PCR方法敏感性结果

2.5 临床样品检测

利用建立的实时荧光RT-PCR方法，对临床发病家禽的10份组织病料进行检测，发现有6份阳性。该方法与病毒分离结果相比，符合率为100%（图6），说明该方法具有良好的准确性。

图6 该方法对临床组织样品的检测结果

3 讨论

随着病毒进化，H5亚型AIV一直在不断变异。我国现在的流行毒株与1996年最初分离的病毒A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）HA核苷酸同源性仅 为 90.6%（Re-11）和91.2%（Re-12）。以Re-11和Re-12疫苗株为代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性仅为88.5%。HA核苷酸的快速变异增加了以核苷酸为靶基因检测方法的难度。

本研究建立和优化了H5亚型AIV实时荧光RT-PCR方法，可以检测出目前常见的H5亚型AIV（包括 H5N1、H5N2、H5N6、H5N8），与其他亚型AIV和其他禽类病原核酸均无交叉反应。该方法的检出率和检测下限均优于商品化H5 AIV核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5 AIV实时荧光RTPCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）。

4 结论

本研究建立的H5亚型AIV实时荧光RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等优点，可用于H5亚型高致病性禽流感的流行病学调查、监测和早期诊断。