两种蓝舌病病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较

韩佃刚，叶玲玲，祝 贺，台晓媛，孙洪正，周晓黎，尹尚莲，艾 军

（1. 云南农业大学，云南昆明 650201；2. 昆明海关，云南昆明 650200；3. 石林彝族自治县农产品质量安全监测站，云南石林 652200；4. 昆明市疾病预防控制中心，云南昆明 650228）

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起反刍动物的一种非接触性虫媒传播疫病。BTV 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），是一种主要由库蠓传播的环状病毒。绵羊是本病的主要易感动物，山羊、牛、羚羊、骆驼及野生反刍类动物均对本病易感。反刍类动物感染BTV的病死率平均为30%，其中绵羊高达80%；牛和山羊常为隐性感染，偶有发病和死亡。世界动物卫生组织（OIE）将BT列为法定通报多种动物共患疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前未有人感染BTV的报道[1]。BT 1933年首次发现于牛[2]，目前分布广泛于全球，美国、澳大利亚、法国、英国、西班牙、韩国等国家均有关于该病的报道。我国于1979年在云南省师宗县首次发现BT。流行病学调查发现，我国已有 31个省（自治区、直辖市）发现BTV 抗体阳性家畜，并从云南、湖北和安徽等地自然感染羊体内分离获得BTV[3]。BT严重损害畜产品国际贸易，是活牛、活羊贸易的重大阻碍，也是进行其他活畜、牲畜胚胎和精子贸易的障碍之一，引起全球各国高度关注。随着我国从国外进口种用反刍动物种类和数量的增加，BT经口岸传入我国的风险加大，因此需要对进境动物严格实施检疫监管，防止该病传入我国[4]。OIE推荐的BTV血清学检测方法为酶联免疫吸附试验（ELISA）、琼脂免疫扩散试验（AGID）、补体结合试验（CFT）、病毒中和试验（VNT）。竞争ELISA（C-ELISA）和阻断ELISA（b-ELISA）是基于一种结合到BTV VP7核心蛋白氨基末端的特异性单克隆抗体而开发的检测方法，在检测中不会与其他虫媒病病毒抗体产生交叉反应[5]。经多个国际实验室的比较研究，ELISA检测程序目前已经标准化，是检测BTV抗体的一种常用方法[6]，可用于多种动物血清抗体检测，其特异性和敏感性高，成本低，已被广泛用于临床BT的诊断检测[7-8]。

目前商品化的BTV抗体ELISA检测试剂盒主要由美国、法国、西班牙等国家生产。进口试剂盒价格较高，订货周期长，不能有效满足基层动物检疫机构开展大规模筛查需求，因而开发性价比高的国产试剂盒势在必行。本试验用的ELISA检测试剂盒由昆明、深圳海关检验检疫技术中心和云南省畜牧兽医科学院等单位共同研制和转化。昆明海关检验检疫技术中心根据进出境动物检疫需求，于20世纪80年代研制出BTV琼扩抗体检测试剂，并于2009年研制出BTV B-ELISA抗体检测试剂盒[9]，2018年对该试剂盒生产工艺进行了改进（完成了ELISA试剂盒的抗原预包被和辣根过氧化物酶与单抗偶联的工艺改进），研制的新型BTV ELISA抗体检测试剂盒检测时间由原来的4.5 h缩短至2.5 h。为进一步评估新型BTV ELISA抗体检测试剂盒检测临床样品的适用性，将自主研发的B-ELISA抗体检测试剂盒（YN BTV B-ELISA）与法国ID.VET公司研制的ELISA抗体检测试剂盒（ID.VET C-ELISA）进行比较试验，以期为临床检测提供性价比高、使用方便、特异性高、灵敏度高的试剂盒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检血清 本实验室保存的牛羊血清1 278份。任选1份已确定的羊阳性血清，按照20～2-9进行10倍倍比稀释，共10份。

1.1.2 检测试剂盒 BTV抗体B-ELISA 检测试剂盒（以下简称YN BTV B-ELISA）：昆明海关检验检疫技术中心试制，批号HM181005；BTV VP7蛋白抗体ELISA检测试剂盒（以下简称ID.VET C-ELISA）：法国ID.VET公司研制，批号C42。

1.2 检测方法

1.2.1 符合率比较 用2种ELISA试剂盒，对1 278份血清进行检测，操作步骤和结果判定均参照相应试剂盒说明书进行。参考吴泰相等[10]的方法（表1），计算符合率、相对敏感性和相对特异性。符合率=(a+d)/(a+b+c+d)；相对敏感性=a/(a+c)；相对特异性=d/(b+d)；Kappa值计算公式：Kappa=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)。Kappa值 ＞0.8，表明一致性极高；0. 60＜Kappa值≤0. 80；表明高度一致；0. 40＜Kappa值≤0. 60；表明中度一致；Kappa值≤0. 40，表明一致性差[11]。

表1 两种试剂盒一致性判定方法

1.2.2 敏感性比较 任选一份已确定的阳性血清，按照20～2-9进行10倍倍比稀释，共10份，分别用2种ELISA试剂盒进行检测。每个浓度的血清均做双孔检测，操作步骤参照相应试剂盒说明书进行。取2个检测孔的OD平均值进行判定，比较两种试剂盒的敏感性。

2 结果

2.1 符合率比较

用上述方法对1 278份血清样品进行检测，结果见表2。YN BTV B-ELISA试剂盒与ID VET C-ELISA试剂盒检测比较结果显示，两者同时为阳性和阴性血清分别有267份、1 010份，YN BTV B-ELISA试剂盒阳性而ID.VET C-ELISA试剂盒阴性的血清0份，YN BTV B-ELISA试剂盒阴性而ID.VET C-ELISA试剂盒阳性的血清1份。YN BTV B-ELISA试剂盒与ID.VET C-ELISA试剂盒的符合率、相对敏感性、相对特异性分别是：(267+1 010)/1 278×100%=99.92%，267/268×100%=99.63%，1 010/1 010×100%=100%。将两者一致性用Kappa值表示，Kappa =2(267×1 010-0×268)/(267×1 010+268×1 011)≈0. 998。

表2 YN BTV B-ELISA试剂盒与ID.VET C-ELISA 试剂盒检测结果比较

2.2 敏感性比较

用上述方法对10个浓度的阳性血清样品进行检测，检测结果见表3。同一份阳性血清10个浓度稀释后的检测结果显示，ID.VET C-ELISA试剂盒检测到的最低浓度为2-4，即按照1:16稀释，而YN BTV B-ELISA试剂盒能检测到的最低浓度为2-7，即按照1:128稀释。检测结果表明，YN BTV B-ELISA试剂盒的敏感性更高。

表3 YN BTV B-ELISA试剂盒与ID.VET C-ELISA 试剂盒敏感性比较

3 讨论

两种试剂盒设计原理相同，均为基因工程表达的VP7蛋白预包被ELISA板，反应程序均为加样品后孵育一定时间，不洗板，加HRP标记的单抗，反应一定时间后，洗板，显色。根据对1 278份样品检测的比较评估，发现两者的符合率较高，因而推测两种试剂盒的单抗可能作用于VP7蛋白的同一靶位点。反映试验判定结果与标准诊断结果一致性的2个指标是符合率和Kappa值，而反映试验结果真实性是特异性和敏感性[12-13]。试剂盒敏感性高低会直接影响对同一样品的判定，在检测时敏感性低，对弱阳性样品会出现假阴性，漏检的可能性增加。为保证检测结果的准确性和可靠性，实验室在使用试剂盒前应对其进行测试验证。在测试验证时，测试样品的范围要广，应尽可能多地选取不同的、有代表性的测试样品[14]。本次测试的样品为来自澳大利亚、新西兰和云南边境地区的牛羊血清，样品范围在动物品种上涵盖了牛和羊，在地域上涵盖了国内和国外，因而具有一定的代表性。

4 结论

本次比对结果表明，YN BTV B-ELISA试剂盒与ID.VET C-ELISA检测试剂盒之间的符合率、相对特异性、相对敏感性都较高，在动物疫病群体检测中无根本性差别，并且YN BTV B-ELISA试剂盒的敏感性更高，成本更低。这些特点表明YN BTV B-ELISA试剂盒在大规模样品检测中的优势更加明显。