蓝舌病I型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

陈玉梅，党伟华，刘燕凯，周景明，刘红亮，郭亚楠，张改平，王爱萍

（郑州大学生命科学学院，河南郑州 450000）

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）感染引起的，经昆虫传播的一种疾病[1]，被我国列为一类动物疫病。目前尚未发现人类感染BTV的报道[2]。BTV主要感染牛、羊等反刍动物[3]，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属 （Orbivirus）蓝舌病病毒亚群（Bluetongue virus subgroup）。现在报道的BTV有27种血清型，且每种血清型之间无交叉保护[4-7]。BTV基因组由大片段（L1～L3）、中片段（M4～M6）、小片段（S7～S10）组成，共编码7种结构蛋白（VP1～VP7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4）[8]。BTV有双层蛋白衣壳结构：VP2和VP5构成外壳，VP3和VP7构成内壳[9]。VP2能够诱导产生中和抗体，而VP5能够增强VP2产生中和抗体的能力，因此VP5可以用于病毒样颗粒装配和基因工程疫苗研究[10]。本研究利用原核表达系统表达了BTV-1型病毒的VP5蛋白，又对其免疫原性进行了研究，以期为进一步研究VP5蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种PET-28a：郑州大学分子免疫室保存；IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素、Bradford蛋白浓度测定试剂盒：Solarbio公司产品；His单抗、HRP标记的羊抗鼠酶标二抗：Abbkine公司产品；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒：TIANGEN公司产品。BamHI、XhoI、T4DNA连接酶、蛋白Marker、核酸Marker：由TaKaRa公司提供；BTV-1型灭活病毒：云南省畜牧兽医科学研究院捐赠。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成及引物设计 根据BTV-1 VP5蛋白在NCBI GenBank公布的序列（GenBank accession No.AGW27485.1），按照E.coli密码子的偏爱性，优化BTV-1 VP5蛋白基因序列，同时根据合成的VP5基因序列，设计VP5基因引物：VP5-F：AAGGATCCATGGGTAAAGTGATCCGCTCCCT；VP5-R：AACTCGAGTTAAGCGTTACGCAGGAACAGT。

1.2.2 重组表达载体构建及鉴定 以VP5基因序列为模板进行PCR扩增。程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32 个循环；72 ℃ 10 min。回收目的片段，将VP5和PET-28a分别用BamHI 和XhoI双酶切，连接并转化至E.coli DH5α感受态细胞；挑单克隆培养，将阳性菌液送生物公司测序。

1.2.3 VP5重组蛋白表达及可溶性分析 转化阳性重组质粒至BL21（DE3）感受态细胞，挑单克隆进行培养；将阳性菌液1:100接种于50 mL Kan+抗性的LB培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG 25 ℃诱导表达6 h，12 000 r/min离心诱导表达后的菌液10 min；弃上清，用1 mL PBS重悬菌体并进行超声破碎（时间分别为10 min、3 s，间歇3 s，功率为45 w），12 000 r/min离心15 min；分离上清和沉淀，用SDS-PAGE、Western-blot分析蛋白可溶性。

1.2.4 VP5重组蛋白表达条件优化

1.2.4.1 培养基成分优化 表达菌1:100分别接种于10 mL LB和2×YT培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG，25 ℃诱导表达10 h；分别在0、2、4、6、8、10 h测菌体OD600nm，分析生长速率，用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。

1.2.4.2 诱导剂IPTG浓度优化 表达菌1:100接种于6瓶10 mL 2×YT培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG，25 ℃诱导表达10 h；分别在0、2、4、6、8、10 h测菌体OD600nm，分析生长速率，用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。

1.2.4.3 诱导表达时间 表达菌1:100接种于6瓶10 mL 2×YT培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG，25 ℃分别诱导表达2、4、6、8、10 h，用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。

1.2.4.4 金属离子种类 表达菌1:100接种于5瓶10 mL 2×YT培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，分别加入Ca2+、Fe3+、Mg2+、K+，在0.2 mmol/L IPTG 25 ℃条件下诱导表达6 h；分别在0、2、4、6、8、10 h测菌体OD600nm，分析生长速率，用SDSPAGE分析目的蛋白表达情况。

1.2.4.5 诱导温度 表达菌1:100接种于3瓶10 mL 2×YT培养基，37 ℃震荡培养至OD600nm=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG，分别在20、25、30 ℃诱导表达10 h，用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。

1.2.5 蛋白纯化 取表达后的菌液100 mL，12 000 r/min 离心10 min，弃上清；用10 mL PBS重悬菌体，超声破碎；将超声后的上清液12 000 r/min 离心15 min，0.22 mm滤膜过滤后用镍亲和层析法纯化，通过优化平衡液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）、洗涤液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）和洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl+300 mmol/L NaCl+咪唑）中咪唑的浓度，使其达到最好的纯化效果，并用SDS-PAGE、Western-blot鉴定纯化效果。

1.2.6 动物试验 将15只6～8周龄的Balb/c小鼠随机分成3组，每组5只。低剂量组，每只免疫20 mg的VP5蛋白；高剂量组，每只免疫40 mg的VP5蛋白；PBS免疫组，作为阴性对照。首免用完全佐剂和蛋白/PBS混合乳化，二免和三免均用不完全佐剂和蛋白/PBS混合乳化。每3周免疫1次，免疫后分别于0、7、14、21、28、35、42、49、56 d尾静脉采血，用Dot-ELISA、间接ELISA评价免疫效果。

1.2.7 免疫效果初步评价

1.2.7.1 Dot-ELISA测定免疫血清与灭活BTV-1反应性 将条状NC膜在磷酸盐缓冲液（PBS）中完全浸湿，室温晾干；取1 mL灭活BTV-1点在膜上，再取1 mL VP5蛋白和1 mL PBS分别作为阳性对照和阴性对照，以1:500稀释的阳性血清作为一抗，1:5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠作为二抗，采用AEC显色，分析试验结果。

1.2.7.2 间接ELISA测定免疫血清效价 将纯化的VP5蛋白作为包被原，以80 ng/孔的包被量包被96孔板，每孔50 mL，4 ℃包被过夜；第2天弃去包被液，用PBST洗涤3次，封闭，37 ℃孵育1 h；弃去封闭液，用PBST洗涤3次；测效价时，分别加入起始体积分数为1:100的2倍倍比稀释的免疫血清；抗体消长规律测试时，分别在0、7、14、21、28、35、42、49、56 d 加入 1:1 000 稀释的免疫血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠，37 ℃孵育1 h；用PBST洗涤3次，然后加入TMB显色液，5 min后终止显色；测OD450nm，评价免疫效果。

2 结果

2.1 原核表达载体构建

目的基因PCR结果显示，有1条1 600 bp大小的条带（图1-A），与预期的VP5大小一致；双酶切（图1-B）鉴定显示，插入的VP5 基因与预期相符，测序显示基因序列正确，说明重组质粒28a-VP5构建成功。

2.2 重组蛋白初步表达及可溶性分析

将重组质粒28a-VP5转化BL21（DE3）感受态细胞，初步诱导表达后进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果显示，与未诱导的对照菌相比，经IPTG诱导后的菌在约62 kDa处有1条明显的蛋白条带（图2-A、图2-B），与预期结果一致，说明目的蛋白成功表达。诱导表达菌体经超声破碎后，进行SDS-PAGE。结果显示，重组蛋白VP5主要以可溶形式表达（图2-C）。

图1 目的基因扩增（A）和重组质粒的双酶切鉴定（B）

2.3 重组蛋白表达条件优化

表达条件优化结果显示，2×YT培养基中E.coli菌体生长速率明显比LB培养基快（图3-A），IPTG浓度对E.coli菌体生长速率影响不大（图3-B）；SDS-PAGE结果显示，IPTG对目的蛋白的表达量影响也不显著。因此，选择最低的0.2 mmol/L为最佳IPTG浓度。随诱导时间的延长，目的蛋白表达量明显增加，6 h后目的蛋白表达量最高（图3-C），而Ca2+、Fe3+、Mg2+、K+对E.coli菌体生长速率及目的蛋白表达量的影响均不显著（图3-D）；25 ℃时，目的蛋白可溶性表达量最高（图3-E）。基于上述优化结果，重组蛋白的最佳表达条件为：选择2×YT培养基，在IPTG浓度为0.2 mmol/L时25 ℃诱导表达6 h，目的蛋白表达量最高。

图2 诱导表达的VP5蛋白SDS-PAGE（A）、Western-blot（B）、可溶性分析（C）

2.4 NI柱层析法纯化VP5蛋白

通过优化纯化条件，用20 mmol/L咪唑的平衡液平衡柱子，40 mmol/L咪唑的洗涤液洗脱杂蛋白，250 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白。SDS-PAGE及Western Blot结果显示，重组蛋白纯化效果较好（图4），纯度约为75%。经Bradford蛋白浓度测定，试剂盒测纯化后的VP5蛋白质量体积分数为1.42 mg/mL。

2.5 免疫效果初步评价

Dot ELISA结果显示，在高剂量组，5只小鼠血清均能与BTV-1发生特异性反应（图5-A：a—e）；低剂量组中，有4只小鼠血清能与BTV-1发生特异性反应（图5-A：f—i），有1只小鼠反应较弱（图5-A：j）；而PBS免疫组小鼠血清均不与BTV-1发生反应（图5-A：k）。这说明E.coli重组表达的VP5蛋白免疫血清可以与BTV-1发生特异性反应。用纯化的VP5蛋白包板，ELISA测定血清效价。结果显示，高、低剂量组均能产生针对VP5蛋白的较高效价的特异性抗体，抗体效价在 1:1.024×105～1:2.048×105之间（图5-B），且随着免疫时间的推移，两组抗体滴度均呈现增长趋势，而PBS对照组均无特异性抗体产生（图5-C）。

图3 重组蛋白VP5的表达条件优化

图4 纯化后的VP5蛋白SDS-PAGE（A）及Western Blot鉴定（B）

3 讨论

本研究利用原核表达系统表达BTV-1 VP5蛋白。为了提高表达量，对培养基成分、IPTG浓度、诱导时间、金属离子、诱导温度等诱导表达条件进行优化，获得最佳表达条件为： 2×YT培养基、IPTG浓度为0.2 mmol/L、25 ℃ 诱导6 h。此条件下的蛋白表达量最高，金属离子对表达量影响不大。

BTV外层衣壳由VP2和VP5构成，有研究表明，VP5能增强VP2中和抗体的产生[10]。也有研究表明VP2虽然能诱导机体产生中和抗体，但不能对机体提供完全有效的保护，而VP5的添加能够明显增强VP2的保护作用，这可能是两者协同作用的缘故，也可能是VP5改变了VP2的空间构像[11]。因此，VP5的研究对BTV疫苗的研制具有重要意义。

图5 Dot ELISA结果（A）、血清效价（B）和抗体消长规律（C）

有研究用带有MBP标签表达的BTV-12 VP5蛋白，获得了约112.2 kDa的MBP-VP5蛋白，但其抗原性不太好，在5份山羊血清中只有1份为阳性[11]。天然的BTV-1 VP5蛋白大小约为59.2 kDa。而本试验选用His标签融合表达BTV-1 VP5蛋白，获得的重组蛋白His-VP5大小约为62 kDa，与预期一致。通过免疫Balb/c小鼠获得免疫血清，经Dot-ELISA证实，重组BTV-1与重组蛋白His-VP5免疫的阳性血清均能发生特异性反应；ELISA结果显示，高、低剂量组VP5免疫均能产生针对VP5蛋白的高效价特异性抗体，效价范围为1:1.024×105～1:2.048×105，而 PBS 免疫的阴性对照组均无特异性抗体产生，说明本试验获得的重组VP5蛋白具有良好的免疫原性。这可能是由于His-标签分子量小，在pH8.0时不带电，且无免疫原性，对蛋白质的分泌、折叠功能基本无影响。本试验发现其对VP5蛋白自身结构的影响也不大，与之前的研究相一致[12]。

4 结论

本研究经原核表达系统获得了BTV-1 VP5蛋白。该蛋白的免疫血清能够与BTV-1灭活病毒发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，这为开展BTV-1 VP5蛋白相关研究工作奠定了基础。