一株猪源乳杆菌的分离鉴定

张云娟，刘洪明

（1.福建省浦城县动物卫生监督所，福建浦城 353400；2.烟台市农业综合执法支队，山东烟台 264000）

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是指一类能发酵糖类产生乳酸的无芽胞、革兰染色阳性细菌的总称，是应用最早的一种益生菌，已被广泛添加于各种动物的饲料中。目前，市场上大部分乳酸杆菌菌株是从人和哺乳动物肠道中或土壤中分离到的[1]。由于乳酸菌的益生作用具有宿主特异性，即分离自同一动物肠道的菌类，一般只在本类动物肠道定殖发挥作用效果更好。为了寻找一种能够应用于猪的益生菌，本研究从猪小肠中分离猪源乳酸菌，并对分离的1株乳杆菌进行了详细的鉴定，为下一步乳酸菌益生效果的评价提供菌种来源。

1 材料与方法

1.1 实验样品

采取昆明某屠宰场猪消化道全套样品，无菌采取样品于无菌容器内，立即送检。

1.2 菌株的分离与初步鉴定筛选

将小肠样品去除粪便，无菌剪开用生理盐水冲洗，再用生理盐水将样品依次进行10，102，103，104，105，106稀释，取 1mL 稀释液倾注培养于加碳酸钙MRS培养基内，各稀释度倾注2个瓶皿，分别在37℃的恒温培养箱中厌氧培养48h。挑取单个有典型溶钙圈的菌落，MRS平板划线传代，纯培养[2]。

1.3 乳酸菌生理生化鉴定

根据革兰氏染色镜检，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[2]及《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和第九版[3，4]，对该株乳酸菌进行以下生化鉴定实验。

1.4 乳酸菌16SrDNA基因测序及同源性分析

首先通过MRS液体培养基37℃厌氧培养至对数生长期，按照BIOTEKE公司细菌DNA提取试剂盒(DP2001)说明，提取乳酸菌的总DNA。利用提取的细菌全基因组DNA作为模板，进行16sDNA PCR扩增。PCR产物，封口膜封口后，送大连宝生物（TaKaRa）公司进行测序。利用Blast，Clustal，DNAman，MEGA 等生物软件将测序结果与GenBank下载的菌株16sDNA序列进化树构建并进行同源性分析。同源性达到97.5%认为是一个种或亚种。

2 实验结果

2.1 分离菌株的菌落特性结果

该株纯菌种接种到加CaCO3 MRS平板，该菌株菌落特性有溶钙圈，菌落形态呈大小不一，白色圆形，边缘光滑，湿润有光泽的菌落特征。见图1。

图1 LP1乳杆菌菌落特征图

2.2 分离菌株的染色形态特性结果

将该株乳杆菌进行革兰氏染色镜检，1000倍光镜下该株乳杆菌为无鞭毛，无荚膜，无芽孢的蓝紫色革兰氏阳性杆菌。见图2。

图2 LP1乳杆菌染色特征图

2.3 分离的该菌株的生理生化特性结果

将该株乳杆菌进行属的生化试验，运动性（-）、过氧化氢酶（-）、吲哚（-）、明胶液化（-）、硫化氢（-）、硝酸盐还原（-）、pH4.5 MRS 生长（+），种的生化特性全为阴性。参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《伯杰氏鉴定手册》，初步判断LP1为乳杆菌属，基本推断LP1为格氏乳杆菌。

2.4 同源性比对结果

16s-rRNA扩增的DNA送大连宝生物(TaKaRa)公司进行测序，测序的猪源乳杆菌用Blast、Clustal、MEGA 和 DNAstar 等生物软 件分析，构建遗传进化树（见图3），由遗传进化树可知，LP1与 L.gasseri（格氏乳杆菌）在同一分支上，说明LP1与L.gasseri的亲缘性最近。根据进化树的亲缘性关系选择处在同一大枝上的11条序列进行同源性比对（见图4），由同源性比对图可知，LP1与格氏乳杆菌的同源性为98.7%。表型鉴定结果与分子生物学鉴定结果一致，即LP1为格氏乳杆菌。

图3 LP1乳杆菌的进化树

图4 LP1乳杆菌的同源性图

3 讨论

益生菌的菌株具有较强的针对性和特异性，在其被制作成活菌制剂后也有一定的专一性，因此本研究直接从健康的猪肠道中进行乳酸杆菌的分离。

(1)益生素具有无污染、无药物残留、不产生耐药性等优点，符合可持续发展的要求。乳酸杆菌制剂作为一种益生素，可通过生物拮抗、改善动物肠道的生态环境及提高动物免疫力等机制发挥其益生素的作用，已被广泛地应用于动物生产中[5]。

(2)乳酸杆菌微生态制剂作为一种优质的环保生态产品，应用前景广阔[6]。

不同种动物宿主来源的益生菌对动物肠道上皮的粘附性是不同的，影响微生态制剂的使用效果。益生菌的粘附性好坏也是决定益生素质量的关键因素之一[7]。家畜微生态制剂使用的菌种最好为经鉴定的具有优良粘附性的源自家畜的益生菌。此次试验分离到乳酸菌可进一步为乳酸菌益生效果研究提供菌种来源，从而为微生态制剂的制备筛选优良菌种。