苦参碱调控肝癌细胞HepG2自噬作用机制研究

郭 浩，周淑妮，冉瑞智

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

全球每年有超过60万患者死于肝癌，其中50%发生在中国[1-2]。目前，肝癌的有效治疗方法是手术切除和肝移植，再辅助放射治疗、化学治疗（简称放化疗），但患者5年生存率仅为5%[3]。加之大部分肝癌患者合并肝硬化，限制了化疗药物的使用[4]，有必要寻找同时具有抗肿瘤和抗纤维化活性的药物。目前，苦参碱已被广泛应用于肝炎、肝纤维化、癌症等疾病的治疗[5]，但对其抗肿瘤作用的确切机制研究还不够深入[6-7]。研究发现，苦参碱可诱导肿瘤细胞发生Ⅱ型程序性死亡，即自噬[8]，但机制尚不清楚。有研究证实，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路在肿瘤细胞自噬过程中发挥关键作用[9]。本研究中将不同剂量苦参碱作用于肝癌细胞HepG2，确认肝癌细胞HepG2是否发生了自噬，同时初步探讨其分子机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

试药：苦参碱（西安天园生物制剂公司，批号为16092317，纯度≥99%）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号分别为PM150210B，164210-100）；胰酶（美国 Gibco公司，批号为 11080907）；单丹磺酞戊二胺（MDC，美国 Sigma公司，批号为15596018）；Trizol ReagentRNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司，批号为15596018）；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）RNA反转录试剂盒（大连TaKaRa公司，批号为RR047A）；荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程<大连>有限公司，批号为TK08045）；细胞蛋白抽提试剂（碧云天生物技术研究所，批号为P0033）；鼠抗p-Akt（Ser473）抗体，兔抗 Akt、mTOR、自噬相关蛋白 LC3B 抗体，均购自美国Santa Cruz公司，批号分别为HZ-0670R2，HZ-0670R1，HZ-0670R22，HZ-0673R6；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗小鼠IgG、HRP标记抗兔IgG和鼠抗GAPDH抗体均购自武汉艾美捷科技有限公司（批号分别为 115-035-003，C1313）。

仪器：TE2000-U+PXM1200型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；MCO-15AC型CO2细胞培养箱和 NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪（美国Thermo Revco公司）；CFX96型 PCR 仪 Mini-PROTEAN Tetra型垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）；ChemiDoc TMXRS型凝胶成像仪（美国UVP公司）。

细胞：肝癌细胞HepG2，购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库，批号为CM-1250。

1.2 方法

细胞培养及分组：用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃及5%CO2条件下培养肝癌细胞HepG2，隔天换液，取处于对数生长期的肝癌细胞HepG2，分为对照组及苦参碱低、中、高剂量组，待细胞贴壁后弃培养液，加入终质量浓度依次为0，0.5，1.0，2.0 g/L的苦参碱，继续培养48 h后收获细胞。

MDC染色观察自噬体：取培养细胞加入MDC（终浓度为50 μmol/L），室温避光染色10 min后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，再加入无MDC的DMEM培养基，在380 nm波长处观察细胞染色情况。自噬细胞质呈绿色荧光亮点。

RT-PCR法检测 Akt、mTOR和 LC3B mRNA表达：取培养细胞，5 000 r/min离心5 min，以Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH引物为内参。Akt上游 5′-AGACATACATCTTTGCTGGAGACA-3′，下 游 5′-CTTGAAGAAGTAGCTGTGACCG-3′；mTOR上游 5′-AGAAGGGTCCCAGCTA-3′，下游 5′-TATTC GGGGTGATCGG-3′；LC3B 上 游 5′-ACTGGATTTGC GGCATGTGA-3′，下游 5′-CCATGTTGAAGTAGGAGC GAGTGA-3′；GAPDH 上游 5′-TCCCATCACCATCTTC CAG-3，下游 5-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′；PCR条件95℃预变性1 min；95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循环40次，72℃延伸5 min终止反应。读取循环阈值（Ct值），采用2-△△Ct表示目的基因mRNA的 表 达 量。以 Akt/GAPDH，mTOR/GAPDH，LC3B/GAPDH比值分别代表各自的相对表达水平，各组设3个复孔，重复3次。

Western Blot法检测 Akt、p-Akt、mTOR 和 LC3B蛋白水平：取培养细胞，5 000 r/min离心5 min，洗涤2 次，加入 1 μL PMSF，加入蛋白抽提试液，冰浴 2 h；4 ℃下10 000 r/min离心15 min，取上清液，检测蛋白含量；调整蛋白浓度，加入1/5体积的5×Buffer，沸水变性，进行电泳、转膜；加入一抗，4℃下孵育过夜，回收一抗，清洗加入二抗，加入发光试剂，显影、定影、清洗，将目的条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度值之比为各目的蛋白相对表达水平，各组设3个平行样，重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件分析。计量资料以均数±标准差（）表示，行单因素方差分析；组间两两比较用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对细胞自噬行为的影响

结果见图1。与对照组比较，苦参碱高、中、低剂量组肝癌细胞HepG2荧光强度明显增强，且与剂量呈正相关，说明苦参碱诱导肝癌细胞HepG2发生了自噬。

2.2 对细胞AKT和 p-Akt蛋白表达的影响

结果见表1。与对照组比较，苦参碱高、中、低剂量组肝癌细胞HepG2 Akt mRNA和蛋白表达水平无明显差异（P>0.05），肝癌细胞HepG2p-Akt蛋白表达水平明显降低（P<0.05），且与剂量呈正相关。

2.3 对细胞mTOR mRNA和蛋白表达的影响

结果见表2。与对照组比较，苦参碱高、中、低剂量组肝癌细胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05），且与剂量呈正相关。

2.4 对肝癌细胞HepG2 LC3B表达的影响

结果见表3。与对照组比较，苦参碱高、中、低剂量组肝癌细胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05），且与剂量呈正相关。

图1 苦参碱诱导肝癌细胞HepG2自噬行为（×320，箭头标记处为自噬体）

表1 各组肝癌细胞HepG2 Akt和 p-Akt蛋白表达水平比较（±s，n=3）

表1 各组肝癌细胞HepG2 Akt和 p-Akt蛋白表达水平比较（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P<0.05。表2、表3同。

组别对照组苦参碱 低剂量组中剂量组高剂量组质量浓度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 Akt mRNA 1.02±0.06 0.98±0.03 1.04±0.03 1.02±0.05 Akt蛋白1.67±0.23 1.84±0.18 1.73±0.22 1.77±0.31 p-Akt蛋白1.11±0.17 0.83±0.14*0.57±0.06*0.39±0.05*

表2 各组肝癌细胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表达水平比较（±s，n=3）

表2 各组肝癌细胞HepG2 mTOR mRNA和蛋白表达水平比较（±s，n=3）

组别对照组苦参碱 低剂量组中剂量组高剂量组质量浓度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 mTOR mRNA 0.98±0.04 0.85±0.08*0.63±0.06*0.46±0.07*mTOR蛋白1.12±0.12 0.97±0.13*0.79±0.09*0.36±0.06*

表3 各组肝癌细胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表达水平比较（±s，n=3）

表3 各组肝癌细胞HepG2 LC3B mRNA和蛋白表达水平比较（±s，n=3）

组别对照组苦参碱 低剂量组中剂量组高剂量组质量浓度（g/L）0 0.5 1.0 2.0 LC3B mRNA 1.00±0.03 1.63±0.16*2.57±0.32*3.15±0.37*LC3B蛋白0.16±0.03 0.28±0.05*0.71±0.16*1.55±0.22*

3 讨论

苦参碱是一种从豆科槐属植物中提取的生物碱，主要从苦参、苦豆子中提取，在肝炎、肝纤维化、肿瘤治疗等方面有重要价值[10]。目前，我国已批准了多种含有苦参碱成分的药物，临床药理试验结果显示，对中晚期肝癌患者给予苦参碱注射液能显著提高抗肿瘤效果，延长生存时间和改善生活质量[11]。体外研究显示，苦参碱能抑制肿瘤细胞增殖和转移，促进肿瘤细胞凋亡[12]。同时，研究苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡过程时，发现苦参碱还可诱导大鼠神经胶质瘤细胞产生大量的自噬体，出现自噬现象[13]。

自噬现象广泛存在于真核细胞的生物学过程中，是细胞在应激状态下的自我消化过程，作为一种细胞程序性死亡，对体内细胞合成和降解稳态的维持具有重要意义[14]。自噬是一把“双刃剑”，抑制自噬可促进肿瘤细胞持续增殖，同时，当无法提供肿瘤生长所需的足够营养时，自噬体通过降解肿瘤细胞的蛋白或细胞器来提供能量，维持机体或细胞的生存[15]。自噬泡的形成是自噬的关键步骤，通常通过形态学和特殊标志分子检测细胞的自噬情况，形态学检测通常用MDC染色进行，细胞中LC3B含量与自噬泡的数量呈正相关[16]。本研究结果显示，苦参碱处理后肝癌细胞HepG2荧光强度明显增强，且与剂量呈正相关，说明苦参碱诱导肝癌细胞HepG2发生了自噬；同时，LC3B mRNA和蛋白表达水平随苦参碱剂量增加而升高，也验证了肝癌细胞HepG2发生了自噬。

近年有研究发现，很多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞自噬，甚至直接导致肿瘤细胞自噬性死亡，故认为自噬现象是治疗肿瘤的一种新途径[17]。目前对自噬现象分子机制的研究还处于框架阶段，PI3K/Akt/mTOR通路被认为是细胞自噬的主要调控途径[18]。PI3K可磷酸化磷脂酰肌醇4-磷酸和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，产物可激活Akt，Akt是PI3K/Akt/mTOR通路下游主要的效应分子，当其磷酸化被抑制时促进细胞自噬的发生[19]。mTOR是细胞自噬的负调控因子，抑制自噬的发生，发挥“门卫”作用。研究证明，通过抑制mTOR可促进HeLa细胞、肝癌细胞HepG2等自噬[20]。本研究结果显示，苦参碱处理后肝癌细胞HepG2内Akt mRNA和蛋白表达变化不明显，但Akt的磷酸化被明显抑制，同时，mTOR也受到抑制，与之前的研究结果相一致。

综上所述，苦参碱可促进肝癌细胞HepG2的自噬作用，其机制与抑制PI3K/Akt/mTOR通路相关。