曲格列酮对低氧状态下肺动脉平滑肌细胞的作用机制研究*

杨中静，皮卫峰，朱萍萍

（上海建工医院呼吸科，上海 200083）

形成肺动脉高压的机制非常复杂，其中低氧引起的肺血管收缩和肺血管重塑（PVR）是一个重要机制。低氧可导致肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）过度增殖，从而导致PVR[1]。增殖体过氧化物酶激活受体γ（PPARγ）激动剂是一种平滑肌细胞生长的负性调节剂，在体内外均能抑制平滑肌细胞增殖。既往研究显示，PPARγ激动剂在多种细胞内均能通过对抑癌基因PTEN的调节作用影响细胞的代谢、增殖和凋亡[2-4]，但对低氧状态下的PASMCs能否通过调节PTEN发挥作用则尚未见报道。因此，本研究中观察了PPARγ激动剂曲格列酮对低氧状态下PASMCs的增殖、凋亡及PTEN/Akt表达的影响，并进一步通过PTEN抑制剂阻断PTEN/Akt通路观察对此作用的影响，以明确其是否通过调节PTEN发挥作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试药

人 PASMCs及细胞培养液（美国 ScienCell实验室）；逆转录试剂盒和聚合酶链反应（PCR）试剂盒（美国Fermentas公司）；CyQUANT细胞增殖检测试剂盒（美国 Invitrogen公司）；小鼠抗 GAPDH、小鼠抗人PTEN（一抗）和羊抗小鼠IgG-HRP（二抗）（美国Santa Cruz公司）。

PTEN和GAPDH引物均由1st base公司（Singapore）合成，PTEN 上游序列：5′-tcaccaactgaagtggctaaaga-3′，下游序列：5′-ctccattcccctaacccga-3′，GAPDH 上游序列：5′-agccacatcgctcagacac-3′，下游序列：5′-taaaagcaggcctggtgac-3′。

曲格列酮（湖北巨胜科技有限公司，批号为20161009，规格为每瓶 10 mg）；GW9662（美国 Sigma 公司，批号为 011M4616V）；bpV（HOpic）（德国 Merck 公司，批号为 S865101）。

1.2 方法

分组：人PASMCs分别加入0.5～60 μmol/L的曲格列酮培养72 h，将培养的PASMCS分为正常对照组、模型组、曲格列酮（20μmol/L）组、曲格列酮（20μmol/L）+GW9662（1 μmol/L）组及曲格列酮（20 μmol/L）+bpV（HOpic，2.5 μmol/L）组。除正常对照组在常氧下培养，其余组均于1%氧体积分数、5%CO2条件下培养。

PASMCs增殖检测：细胞培养48 h后使用细胞增殖检测试剂盒检测PASMCs增殖情况，操作步骤按照说明书进行。

定量PCR检测：采用定量PCR法检测基因的表达水平。使用25 μL的反应体系，定量PCR的循环数设定为40循环，初始变性10 min，随后95℃变性15 s，退火30 s，72 ℃延伸 30 s。

Western blot检测：使用PhosphoSafeTM蛋白提取试剂盒抽提细胞蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，Western blot法检测蛋白表达情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件分析，计量资料以表示，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见图1至图4。曲格列酮在低氧浓度下培养细胞2，8，0.5 h时分别增加 PTEN mRNA 表达（3.2±0.5）倍，Caspase-3 mRNA 表达（3.1 ±0.6）倍，Caspase-8 mRNA（8.9 ±1.1）倍。低氧条件下，曲格列酮浓度为 20 μmol/L时，PASMCs内PTEN与p-Akt的mRNA和蛋白表达水平最高，而Akt无明显变化，使用bpV（HOpic）和GW9662预处理后都能显著抑制曲格列酮引起的PTEN蛋白表达水平升高，且能持续24 h。

3 讨论

过氧化物酶增殖体激活受体（PPAR）属核激素受体超家族，共有 PPARα，PPARγ，PPARδ 3 种亚型，其中PPARγ在调控细胞分化和调控多种代谢（糖、脂肪、能量代谢等）中起重要作用。PPARγ还能通过抑制TGF/smads信号途径而抑制细胞因子和生长因子的信号传导，发挥抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移作用。PPARγ受体在正常肺组织中广泛表达，而重度肺动脉高压患者的肺血管中PPARγ基因及蛋白表达明显降低[5]。对平滑肌细胞PPARγ基因敲除小鼠的研究表明，基因敲除的小鼠自发产生肺动脉高压，引起右心室收缩压上升，右心室的肥厚及远端肺动脉的肌化[6]。

PTEN是PPARγ下游信号通路的一个重要因子。国外的研究表明，PTEN在肺动脉高压发病机制中起了重要作用。在敲除小鼠血管平滑肌细胞的PTEN基因后，发现小鼠平滑肌细胞出现异常增殖，血管重构，以及与肺动脉高压一致的组织病理改变[7]。而同时国内学者研究证实，PTEN/Akt的转录和激活与低氧导致的PASMCs增殖密切相关，并在低氧性肺动脉高压形成过程中发挥重要作用[8]。大量研究表明，PPARγ在不同的细胞内对PTEN具有不同的调节作用，进而影响细胞的代谢、增殖和凋亡[9-12]。既往的研究同样显示，骨成形蛋白-2（BMP-2）能通过上调PTEN的表达抑制低氧状态下PASMCs的增殖，且PPARγ拮抗剂能逆转BMP-2的抑制增殖作用[13]，提示BMP-2通过PPARγ途径发挥作用。

图1 曲格列酮抑制低氧条件下PASMCs增殖情况（×100）

图2 曲格列酮对低氧条件下相关蛋白表达的作用

图3 曲格列酮对低氧条件下相关蛋白表达的作用（GW9662预处理）

图4 曲格列酮对低氧条件下相关蛋白表达的作用[bpV（HOpic）预处理]

本研究结果显示，PPARγ激动剂曲格列酮能抑制低氧条件下人PASMCs的增殖，上调PASMCs的PTEN基因及蛋白和p-Akt蛋白的表达；提示了PPARγ激动剂曲格列酮可能通过增加PTEN的表达，激活PI3K/Akt信号通路，抑制人PASMCs的水平，从而抑制慢性阻塞性肺疾病患者低氧状态下的肺血管重塑。进一步验证发现，PTEN抑制剂 bpV（HOpic）和 PPARγ拮抗剂GW9662均能逆转曲格列酮的抑制低氧条件下人PASMCs增殖作用，并下调PASMCs的PTEN蛋白表达，进一步证明曲格列酮上调PTEN蛋白的表达是通过PPARγ信号通路途径实现的，而其抑制PASMCs增殖的作用依赖于PPARγ-PTEN途径。

Caspases家族在细胞凋亡中具有关键作用，又称凋亡蛋白酶。Caspase-3为细胞凋亡的终末剪切酶，是诱导细胞凋亡的直接实施者，具有不可替代的地位。而Caspase-8是介导细胞凋亡的关键启动因子，激活下一步级联反应。检测曲格列酮及低氧环境下Caspase-3和Caspase-8基因表达，结果提示，曲格列酮能增强Caspase-3和Caspase-8的活性，说明曲格列酮不仅可以直接抑制人PASMCs的增殖，还同时促进PASMCs的凋亡来抑制其低氧条件下的过度增殖，对抑制慢性阻塞性肺疾病等低氧状态下的肺血管重塑具有重要意义。

综上所述，曲格列酮以剂量依赖性方式通过PPARγ途径增加PTEN的表达，促进低氧条件下PASMCs的凋亡。临床上对于长期处于低氧状态的人群如慢性阻塞性肺疾病患者，应用PPARγ激动剂可能通过抑制PASMCs的过度增殖显著改善肺血管重塑状况，预防或延缓肺动脉高压、肺源性心脏病的发生，显著改善慢性阻塞性肺疾病等低氧状态患者的预后。而针对已发生低氧性肺动脉高压的患者，PPARγ激动剂如曲格列酮可能同样能显著改善其病情，预防其进一步发展。本研究为体外试验研究，证实了PPARγ作为低氧性肺动脉高压的一个重要治疗靶点[14-16]，可能通过多种机制发挥作用。但目前仍需进一步在体内试验及大规模临床试验来进一步明确PPARγ激动剂在低氧状态人群及肺动脉高压患者中的作用特点及临床疗效。