白芨多糖的超声辅助提取工艺及抗氧化活性研究

吴梦晴

（巢湖学院 化学与材料工程学院，安徽 巢湖 238000）

1 研究背景

白芨（Bletilla striata）是一种使用广泛的传统草药，已被证实具有各种生物活性，如有效预防肠粘连、抑制纤溶、保护胃粘膜、抗肿瘤等。因其主归肺、胃经，尤其适宜于治疗肺部和胃部出血，在现代社会是非常重要并值得研究的一味中药[1]。将白芨提取物化学组分进行分析，已经鉴定出近80种次级代谢产物，包括多糖、菲、三萜类、双蒽类化合物等。研究表明白芨提取物对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤的治疗作用是通过炎症反应和抗氧化作用进行调节的[2]。白芨块茎中含有丰富的多糖，可用于治疗消化道粘膜损伤、溃疡、出血、瘀伤和烧伤[2]。白芨多糖是传统中草药中重要的功能因子，其在医药领域有巨大的应用前景，由于其抗衰老、抗菌、抗炎、抗癌（癌症免疫疗法）和对抗肾纤维化作用引起了很多关注[3]。药理研究表明[3]，白芨多糖可诱导血管内皮细胞和生长因子的增殖，增强免疫调节功能，作用于巨噬细胞并模拟细胞表达的一些促炎细胞因子。其原因可能是巨噬细胞表面含有可以结合多糖的受体和介导白芨多糖产生免疫刺激的信号转导调控因子，其中甘露糖受体是最有可能识别多糖并与其结合的凝集素。天然多糖已被广泛用于生物材料，它们表现出生物相容性、低毒性和药物生理活性。据报道[4]，白芨多糖可作为缓控释药物、基因以及组织工程药物的赋形剂，作为滴眼液、水凝胶、胶囊剂、涂膜剂的基质，压片糖衣的隔离层，也可制成一种新型粘膜粘附聚合物。研究表明[5]，从白芨中分离出的新型粘膜粘附多糖改善了左氧氟沙星局部治疗实验性细菌性角膜炎中的眼内渗透。此外，白芨多糖广泛应用于日化行业，研究表明[6]，添加了白芨多糖的化妆品在收敛抗皱、延缓皮肤衰老等方面均有明显的疗效，越来越受到化妆品行业的青睐。因此，优化白芨多糖类化合物提取工艺是充分利用白芨药用资源必须解决的问题之一。

目前，白芨多糖的提取方法主要是传统提取法和新型提取技术。在传统方法中，多糖的提取主要采用回流法，常规方法需要较长的处理时间且效率较低。回流时温度不易控制，易耗费大量的挥发性和有害有机溶剂，造成环境污染。同时，回流过程容易引起多糖的变性与降解，导致样品纯度低[7]。天然多糖的提取技术也在不断研究与完善，包括超临界流体萃取、红外辅助法、微波辅助萃取和超声辅助提取等。其中超声波技术将声化学应用于天然产物提取，与传统和其他现代提取技术相比，超声法被提议作为样品预处理的替代程序和更环保的提取技术，其允许在较短时间、较低的能量及温度下进行重复性实验，简化操作并且显著减少有机溶剂的消耗。因此，本研究采用超声波辅助法对白芨多糖进行提取，通过苯酚-浓硫酸法对多糖的含量及得率进行分析，在考察单因素的基础上设计正交实验对其工艺条件进行系统的研究并通过红外谱图进行结构初步鉴定，从DPPH·、·OH、ABTS+·、O2-·清除率对比分析传统水提法和超声提取法制得的白芨多糖的体外抗氧化能力。旨在保持原有多糖结构的基础上最大程度提高白芨多糖得率，且不影响其营养和活性。

2 材料与方法

2.1 实验材料

原料：白芨（云南普洱）：购于巢湖大药房

主要试剂：无水乙醇、浓硫酸、50 mM Tris-HCl缓冲液、浓 HCl、磷酸盐缓冲溶液（PH7.4）、苯酚、0.75 mM邻二氮菲溶液、ABTS、硫酸亚铁、0.01%H2O2、KBr、葡萄糖标准品、过硫酸钾均为国产分析纯；DPPH粉末（Sigma公司）

2.2 实验方法

2.2.1 白芨粉末的制备

取适宜的白芨块茎切片，称重，置于白色纱布上并放入烘箱（50℃）干燥24 h，待干燥结束后放入粉碎机中，工作3 min，倒出白芨粉末，过50目筛，未达到要求的粉末继续放入机器中粉碎，直至粉末能完全通过筛子，将其置于自封袋，贴标签(含样品名、日期、操作人员等信息），备用的样品放入减压干燥器防止材料吸潮。

2.2.2 白芨多糖的提取实验

（1）传统水提法提取白芨多糖

准确称量白芨粉末5g、125mL蒸馏水于500mL三颈瓶，搭好冷凝回流装置，置于搅拌器开动搅拌，设温50℃，从有回流现象开始计时2 h，反应完毕，取下三颈瓶，冷却至室温再进行离心。将上清液缓慢转移至茄形瓶中，旋转蒸发浓缩至上清液的 1/3，加一定比例的 95%乙醇（1∶4），缓慢搅拌至有絮状沉淀产生，4℃静置过夜，离心，取沉淀，放入烘箱中干燥两至三天（60℃），效果不好可用真空冷冻干燥器干燥。即得到白芨粗多糖。

（2）超声辅助法提取白芨多糖

准确称量白芨粉末5 g于250 mL烧杯中，按照一定料液比加入蒸馏水搅动使其均匀，放置一段时间，再放入数控超声清洗器里，控制温度在50℃，在一定超声功率下进行超声，反应完毕，拿出烧杯，冷却至室温再进行离心。后续步骤同2.2.2（1）。

2.2.3 多糖得率的计算

参照刘长命等[8]的方法绘制葡萄糖标准曲线，称取真空包装的葡萄糖标准品10 mg，加入10 mL的蒸馏水配成1 mg/mL的葡萄糖标准贮备溶液，设置五个浓度梯度（20～100 ug/mL），采用苯酚-浓硫酸法于490 nm处测定吸光度，制做标准曲线得到回归方程。再称量干燥好的白芨粗多糖10 mg溶于100 mL的蒸馏水中配成样品溶液，吸取1 mL样品，采用苯酚-浓硫酸法带入回归方程中算得浓度，白芨得率计算公式为：

白芨多糖得率（%）=样品浓度C×稀释体积×（干燥后所得粗多糖质量m1/测量吸光度所取白芨多糖质量 m2）/白芨粉末质量 m3×100%

2.2.4 白芨多糖超声辅助提取单因素实验

（1）超声时间的影响

称取5 g预实验处理的白芨粉末5份，按照料液比1∶30 g/mL加入相应的蒸馏水，放入超声清洗仪中设定功率为250 W，分别超声提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。 再按照 2.2.2（1）步骤进行旋转蒸发浓缩、醇提、静置、离心、干燥、得到白芨粗多糖，计算得率得到较适的超声时间。

（2）料液比的影响

称取5 g预实验处理的白芨粉末5份，料液比为 1∶20 g/mL、1∶25 g/mL、1∶30 g/mL、1∶35 g/mL、1∶40 g/mL，时间设置为较适的超声时间，功率设置在250 W，再按照上述步骤进行离心、旋转蒸发浓缩、醇提、静置、离心、干燥、得到白芨粗多糖，再测量吸光度，得到较适的料液比。

（3）超声功率的影响

称取5 g预实验处理的白芨粉末5份，以较适料液加入蒸馏水，时间设置为较适时间，功率分别设置 200 W、250 W、300 W、350 W、400 W，再按照上述步骤进行离心、旋转蒸发浓缩、醇提、静置、离心、干燥、得到白芨粗多糖，再测量吸光度，得到较适的超声功率。

2.2.5 白芨多糖超声辅助提取正交实验

根据单因素实验研究结果设计正交实验，因素水平如表1所示。

表1 白芨多糖超声辅助提取正交实验因素水平表

2.2.6 红外光谱结构鉴定

取KBr进行预先干燥一上午，取1 mg左右在超声辅助提取法最优条件下制得的干燥样品于玛瑙研钵中进行研磨，再与100～200 mg经预处理的KBr粉末混匀。压片机压成薄片，上机按照相应程序操作，扫描4000～400 cm－1波数范围的图谱。导出数据，用Origin软件分析图谱信息。

2.2.7 白芨多糖体外抗氧化实验

（1）DPPH·清除率的试验方法

取白芨多糖配制成3种浓度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的样品溶液，参考程丹秋等[9]的方法测定DPPH·清除率。计算公式如下：

DPPH·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As为样品517 nm处的吸光度，Ac为蒸馏水代替多糖溶液加入DPPH-乙醇溶液作空白对照

（2）·OH清除率的试验方法

取白芨多糖配制成3种浓度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的样品溶液，参考韦坤华等[10]的方法测定·OH清除率。计算公式如下：

·OH 清除率（%）=[（A1-A0）/（A2-A0）]×100

其中：A1为样品吸光度；A2为去离子水代替样品及H2O2的吸光度，A0去离子水代替多糖样品溶液作空白对照。

（3）ABTS+·清除率的试验方法

取白芨多糖配制成3种浓度梯度（0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的样品溶液，参考李政红等[11]的方法测定ABTS+·清除率。计算率公式如下：

ABTS+·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As为样品吸光度；Ac为去离子水代替多糖样品溶液作空白对照。

（4）O2-·清除率的试验方法

取白芨多糖配制成3种浓度梯度 （0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL）的样品溶液，参考姜忠杰等[12]的方法测定O2-·清除率。计算公式如下：

O2-·清除率（%）=[（Ac-As）/Ac]×100

其中：As为样品320 nm处的吸光度，Ac为去离子水代替多糖样品溶液作空白对照。

3 结果与分析

3.1 葡萄糖标准曲线的建立

图1 葡萄糖标准曲线

3.2 白芨多糖单因素实验结果

3.2.1 超声时间对白芨多糖得率的影响

超声时间是影响多糖含量的主要因素之一，不同的超声时间对多糖得率的影响不同。从图2可见，随着时间从30 min增加到40 min时，多糖得率缓慢上升，当时间增加到50 min时多糖得率增长幅度最大，且达到最大值6.45%，随后得率呈现下降趋势。超声时间对得率的影响呈现先上升后下降的趋势的原因有可能是随着时间的延长，其介质分子的运动速度、穿透力有所增加，在其他提取条件一致时，适当增加超声时间可以增加多糖溶出。但是超声时间过长可能导致其对细胞壁和细胞膜的破碎已经没有作用，此外多糖分子含有大量糖苷键，时间过长易导致键的断裂从而发生降解。

超声时间应控制在适当的范围内，既要保证提取尽可能的充分，又要保证多糖的纯度。实验证明，超声波作为一种高效的催化手段确实可以大大缩短反应所需的时间，从而达到节约成本的目的。因此，选用超声50 min进行料液比单因素的分析。

图2 超声时间对白芨多糖得率的影响

3.2.2 料液比对白芨多糖得率的影响

料液比也是影响多糖得率的主要因素之一。从图3可见，随着料液比从1:20 g/mL增加到1:40 g/mL，多糖得率先升高后降低，在1:30 g/mL时多糖得率达到最大值7.3%。实验过程中发现当料液比为1:20 g/mL时，经过提取、浓缩、离心等步骤，溶剂量过少，醇沉以后白芨多糖呈现胶状且过于黏稠，不易离心去除上清液，同时为多糖的干燥带来了不便。当增加溶剂体积时，一方面增加了溶剂与提取物的接触面积，一方面便于实验操作减少耗损。但溶剂量过高对超声波的细胞破碎作用造成一定阻力，减压浓缩需要消耗大量时间，后续可能需要分次离心从而造成不小的损耗。因此，选用料液比1:30 g/mL进行超声功率单因素的分析。

图3 料液比对白芨多糖得率的影响

3.2.3 超声功率对白芨多糖得率的影响

超声功率是影响多糖得率的重要因素之一，不同的超声功率对得率的影响也不同。从图4可见，超声功率从200 W到400 W，多糖得率先升高后缓慢降低，在350 W时其值达到最大值7.65%。原因可能是适当增加超声功率，有利于细胞膜和细胞壁的破坏，促使多糖溶出。超声功率过大有可能将部分溶出的多糖分解成小分子的单糖，醇沉时小分子糖溶于乙醇从而降低多糖含量。观察多糖颜色时发现，当超声功率变大，多糖呈现出淡黄色，有可能是超声带有能量从而使得部分原料出现糊化，体系中杂质变多导致得率降低。

图4 超声功率对白芨多糖得率的影响

3.3 正交实验优化提取工艺

3.3.1 正交实验结果分析

根据单因素实验的结果，选取了A（超声功率）、B（料液比）、C（超声时间）作为考察因素，采用L9（34）正交实验设计表进行三因素三水平的正交实验。以多糖的得率作为考察指标来进行实验，实验结果如表2。

从表中可以看出最优工艺选定为A3B3C2，即超声功率为400 W，料液比为 1∶35 g/mL，超声时间为50 min。由R值可知影响白芨多糖得率的因素的主次关系为：超声时间>超声功率>料液比，超声时间和超声功率对多糖得率有显著的影响，而料液比对多糖得率的影响最小。

表2 白芨多糖超声辅助提取正交实验结果

3.3.2 验证实验

取3份预实验的白芨粉末5 g，选择较适的工艺即超声功率400 W，料液比 1∶35 g/mL，超声时间50 min进行三次平行试验，并对三次平行实验所得结果求平均值。经过实验验证在此条件下白芨多糖的得率达到8.18%（表3）。

表3 验证实验结果

3.3.3 提取工艺对比

从表4可知，在不同的提取方法下，多糖得率也不尽相同。分别根据2.3.2（1）传统水提法和的超声法最佳工艺提取白芨多糖，实验结果显示超声辅助法提取的白芨多糖得率为8.18%+0.04%，明显高于传统水提法。蔡锦源等[13]采用超声-微波协同提取的白芨多糖得率为6.98%±0.19%。韩丹等[14]将传统水提法、酶解法、超声波辅助法等方法进行了对比，结果表明超声法制的的多糖含量最高。相关研究均证实超声法提取效果最优。

表4 提取工艺对比实验结果

3.4 红外光谱分析

如图5所示，波数3430 cm-，2910 cm-的吸收峰分别是O-H的伸缩振动峰以及C-H的伸缩振动峰[15-16]，1640 cm-的吸收峰是C-O的不对称伸缩振动峰[17]，波数 765 cm-，914 cm-的吸收峰表明存在吡喃糖残基，波数864 cm-的特征吸收表明存在甘露糖残基。这与芮海云等[18]制备的白芨多糖红外光谱特征峰基本吻合。

3.5 白芨多糖体外抗氧化实验结果

3.5.1 提取方法对DPPH·清除率的影响

图5 白芨多糖红外光谱图

如图6所示，使用水提法和超声辅助法提取的白芨多糖对DPPH·的清除率均会随着多糖浓度的增加而升高，且增幅较大。当浓度达到0.5 mg/mL时，水提法和超声辅助法对DPPH·的清除率分别52.5%、64.7%，略低于蔡锦源等[13]超声-微波协同提取的白芨多糖对DPPH·的清除率，但均高于Qu Y等[19]传统水提工艺的研究结果，而单独超声法提取的白芨多糖对DPPH·清除率的影响目前尚未有相关报道。本次研究结果表明超声法提取的白芨多糖DPPH·清除能力优于水提法提取，原因可能是不同的提取方法制得的白芨多糖纯度存在差异。

3.5.2 提取方法对·OH清除率的影响

如图7所示，使用水提法和超声辅助法提取的白芨多糖对·OH的清除率会随着多糖浓度的增加而增加，且增幅较大。当浓度达到0.5 mg/mL时，水提法和超声辅助法对对·OH的清除率分别为74.6%、86.2%。相较而言，超声法提取的白芨多糖·OH清除能力优于水提法提取，但略低于蔡锦源等[13]超声-微波协同提取的白芨多糖对·OH的清除率。

图6 提取方法对白芨多糖DPPH·清除率的影响

图7 提取方法对白芨多糖OH·清除率的影响

3.5.3 提取方法对ABTS+·清除率的影响

如图8所示，当多糖浓度为0.1 mg/mL、0.3 mg/mL时，两种方法提取的白芨多糖对ABTS+·清除能力无明显差异，但当浓度达0.5 mg/mL时，超声法提取得到的白芨多糖对ABTS+·清除能力优于水提法，清除率分别为39.4%、47.3%。

图8 提取方法对白芨多糖ABTS+清除率的影响

3.5.4 提取方法对O2-·清除率的影响

如图9所示，水提法和超声辅助法提取的白芨多糖对O2-·基本没有清除能力，当浓度达到0.5 mg/mL时，水提法和超声辅助法对O2-·的清除力也只有为7.5%、9.8%，与蔡锦源等[13]的研究结果基本一致。分析其中原因，一方面单糖通过糖苷键聚合成多糖类高分子化合物，其构象复杂且不易伸展，柔性较低，导致羟基被包裹在网络结构内部，羟基相互缔合形成分子内氢键；另一方面可能由于多糖对O2-·清除作用的反应体系中存在促进自由基引发的诱导剂，因此表现出促进O2-·产生的作用[20]。

图9 提取方法对白芨多糖O2-·的影响

4 结论

本研究采用超声辅助法提取白芨多糖，在单因素实验基础上进行正交实验，以此来得到白芨多糖的提取最佳工艺并进行验证。根据实验结果可知超声功率为400 W，料液比为1:35 g/mL，超声时间为50 min时提取工艺最优。超声辅助法较水提法而言可以显著提高白芨多糖的得率且超声法提取的白芨多糖有较高的DPPH·、·OH清除活性，ABTS+·清除能力稍低点，当多糖浓度为0.5 mg/mL 时 DPPH·、·OH、ABTS+·的清除率分别为64.7%、86.2%、47.3%，两种方法提取得到的多糖均无明显的O2-·清除能力。