miR-143与骨肉瘤的研究进展*

詹得文， 胡文龙， 殷嫦嫦

1九江学院基础医学院/九江市转化医学重点实验室(江西九江 332000)； 2九江学院附属医院骨科(江西九江 332000)

骨肉瘤(osteosarcoma)是儿童和青少年中最常见、具有高度恶性和侵袭性的原发性骨肿瘤[1]。目前，新辅助化疗是骨肉瘤治疗主要方式[2]，在其刚兴起的时候骨肉瘤患者的生存有所改善(5年总体存活率提高到60%～70%)，但近几十年来在这一领域几乎没有取得任何进展，化疗抵抗和肺转移仍是骨肉瘤患者最具代表性的死亡原因。如果对骨肉瘤能够实现早期诊断，且有良好的监测、疗效观察以及预后等方面的评估指标，将有利于骨肉瘤的诊疗活动。在这些方面，微RNA(miRNA)由于其特异性强、选择性专一和准确性高等特性成为评价骨肉瘤的理想指标而进入了人们的视野。miRNA 是一段大小约为22个核苷酸的非编码单链RNA，于转录或转录后水平负向调节蛋白的表达[3]。多项研究显示，miRNA除了具有调节各种正常生理功能外，还参与了骨肉瘤的发病机制，且很有可能在疾病的诊断与治疗中起着重要的作用，其中发现miRNA-143(miR-143)与骨肉瘤发病密切相关[4-8]。因此，本研究就近年来miR-143与骨肉瘤发生、发展和转移的机制进展作一综述。

1 miR-143与骨肉瘤概述

miRNA在包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤中可能表现为致癌或抑癌基因的作用，其中miR-143在骨肉瘤组织中明显下调，表现为抑癌基因的作用[3]。骨肉瘤患者血浆中miR-143的含量明显下降，被认为是区别骨肉瘤患者和健康人的标志物[9]。Wei等[10]在150例骨肉瘤患者中研究发现，miR-143 在骨肉瘤组织样本低表达，且miR-143低表达水平与肿瘤体积呈负相关，而与总生存时间和无病生存期均呈正相关。多变量分析发现miR-143的低表达是骨肉瘤预后不良的独立危险因素。Fang等[11]也报道，随着骨肉瘤恶性程度的增加，miR-143的表达呈降低趋势，而上调miR-143表达可能会影响肿瘤进程。miR-143可下调骨肉瘤U2细胞系中hERG基因(其性质为一种电压门控性钾离子通道)mRNA和蛋白的表达[12]。hERG在骨肉瘤细胞中高表达，且hERG可作为癌基因参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡过程，其调控机制可能与NF-κB信号通路有关[13]。

此外，miR-143表达高度保守，能通过与靶基因特异性结合进而发挥抑制细胞增殖、侵袭和转移，促进细胞凋亡等生物学效应，还能增加抗肿瘤药物的敏感性[14]。鉴于此，若能阐明miR-143与骨肉瘤发生、发展和转移之间的作用机制，对骨肉瘤的治疗将更有益处。

2 miR-143与骨肉瘤增殖

体外上调miR-143的表达能明显降低骨肉瘤细胞的生存能力，促进细胞凋亡；而上调体内骨肉瘤细胞中miR-143的表达可导致肿瘤的生长受限，瘤体体积明显减小[15]。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是最常见被激活的信号转导途径，参与了骨肉瘤的发生与发展；此通路的激活具有促进细胞增殖、侵袭和转移以及抑制细胞凋亡和血管生成的能力。

2.1 MAPK 表皮生长因子受体(EGFR)信号与MAPK通路的激活发生在49%的骨肉瘤患者中，且信号的激活还与转移密切相关[16]。Ras是MAPK/ERK的上游信号，同时也是EGFR下游分子。EGFR介导的Ras/Raf/MEK/ERK信号通路被异常激活与肿瘤的发生、发展和结局密切相关[17]。Wang等[18]在骨肉瘤细胞系MG-63中研究发现，miR-143不仅能直接结合K-ras基因3′UTR，而且过表达miR-143能明显抑制K-ras基因mRNA和蛋白质的表达从而抑制细胞增殖。此外，共转染K-ras和miR-143部分逆转了miR-143对骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用。一项评估miR-143在骨肉瘤中作用的研究指出[19]，使用表皮生长因子(EGF)能刺激EGFR的磷酸化并激活基质金属蛋白酶-9(MMP-9)导致骨肉瘤侵袭性增加，而miR-143的表达水平无明显改变。很明显，EGFR 通路磷酸化抑制剂或细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化抑制剂能阻断上述过程。当过表达miR-143时，MMP-9表达明显下降，骨肉瘤侵袭性降低，但EGFR的磷酸化水平没有明显降低。这项研究值得注意的是，miR-143可能是通过抑制EGFR信号介导的MAPK/ERK信号路径抑制骨肉瘤的转移。一项最新的研究显示[20]，MAPK7是miR-143的靶基因，且骨肉瘤细胞中miR-143与MAPK7基因表达呈负相关，上调miR-143表达导致MAPK7蛋白表达量明显下降，骨肉瘤细胞的生存能力以及转移能力也下降。由此可见，miR-143调控骨肉瘤的发生、发展与转移依赖于MAPK信号通路。

3 miR-143与骨肉瘤凋亡

细胞凋亡途径中，内源性途径是由线粒体成分介导，其中B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)蛋白家族受到细胞内信号刺激而介导细胞凋亡起到了关键作用。柳豪[21]应用荧光素酶报告基因实验证实，miR-143能直接结合Bcl-2的靶位点，且Bcl-2基因的3′UTR存在两个靶向结合位点，分别是Human Bcl-2 3′UTR(1811-1817)和Human Bcl-2 3′UTR(4513-4519)。

3.1 内源性凋亡途径 miR-143的低表达水平与骨肉瘤的发展和不良预后有关[10]。恢复骨肉瘤细胞系miR-143的表达能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[15]。这种类似肿瘤抑制作用在许多肿瘤中被发现，比如前列腺癌[22]。miR-143的这种作用是通过直接结合并抑制Bcl-2蛋白表达来实现的，而Bcl-2抗凋亡蛋白在骨肉瘤细胞中高表达并能促进细胞生存[15，23]。另外，在骨肉瘤细胞系中转染miR-143模拟物后，Bax、Bak和Bad蛋白表达均上调，caspase-3蛋白表达也增加[15]。由此可见，miR-143促进骨肉瘤细胞凋亡的机制可能是通过抑制Bcl-2的活性，导致caspase级联的激活而实现的。

此外，环状RNA-UBAP2(circular RNA-UBAP2，circUBAP2)在骨肉瘤组织样本和细胞系中表达均明显上调，且过表达的circUBAP2能以“miRNA 海绵”的方式结合miR-143，从而影响了miR-143对靶基因bcl-2的抑制作用[24]。

4 miR-143与骨肉瘤侵袭及转移

肿瘤的转移是一个多因素复杂的过程，其中上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是主要因素之一。基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)、尿激酶纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等可参与肿瘤EMT[25]。

4.1 MMPs 在正常生理和病理状态下，MMPs能够降解细胞外基质中的蛋白质成分并参与组织重塑、细胞侵袭和转移、增殖和血管生成等过程[25]。小鼠骨肉瘤肺转移模型和骨肉瘤细胞系中均发现MMP-13高表达而miR-143低表达[26]。此外，在骨肉瘤细胞系中过表达miR-143，MMP-13基因mRNA和蛋白表达水平均降低，细胞迁移率也明显下降[27]。Wang等[19]实验结果表明，miR-143还能下调MMP-9基因表达而抑制骨肉瘤细胞的转移。因此，miR-143能抑制骨肉瘤转移是较为确切的，但miR-143下调MMPs表达的直接靶基因却不清楚。另Liu等[28]在骨肉瘤细胞中研究发现，活化的Cdc42结合蛋白激酶1(activited Cdc42 kinase 1,ACK1) 3′UTR是miRNA靶向结合位点，并通过AKT/MMPs通路参与细胞转移。因此，miR-143在AKT通路中的作用关系值得探究。

4.2 PAI-1 纤溶酶原激活物抑制因子-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是uPA成员之一，能够介导纤维蛋白降解作用从而破坏细胞外基质和基底膜[25]。Hirahata等[29]对52例人原发性骨肉瘤样本进行检测发现，PAI-1与MMP-13双阳性者肺转移率高达53.3%，明显高于单阳性或双阴性者。miR-143能直接结合PAI-1 mRNA 3′UTR而抑制PAI-1蛋白的表达，而PAI-1具有促进骨肉瘤侵袭和肺转移的作用经体内外实验证实；同时发现干扰PAI-1表达后MMP-13表达也明显下降，骨肉瘤侵袭能力也下降[29]。这提示，uPA不仅能直接降解细胞外基质中的大多数糖蛋白，还能激活基质金属蛋白酶系统降解胶原蛋白，两者一起促使肿瘤EMT，共同促进骨肉瘤的侵袭和转移，而miR-143能够抑制这一过程。

4.3 TGF-β Li等[30]研究发现，骨肉瘤患者中蛋白聚糖(versican，VCAN)表达上调，且VCAN表达水平与骨肉瘤转移有关。TGF-β1可上调VCAN表达促进骨肉瘤的增殖、侵袭和转移，这种作用是通过Smad2/3信号抑制miR-143的表达来实现的，而miR-143又能直接结合VCAN基因3′UTR抑制其蛋白表达。有研究报道，TGF-β和MMPs、uPA三者之间存在着复杂的相互作用关系，共同参与了肿瘤的EMT[25]，而miR-143可对它们作用的环节实施不同程度的调控。因此，miR-143对抑制骨肉瘤EMT有重要作用，值得进一步深入研究。

裸鼠体内实验报道[31]，过表达miR-143的骨肉瘤肺转移裸鼠模型-新鲜肺部组织中GTP 酶激活蛋白(ASAP3)和Musashi 同源物2(MIS2)蛋白的表达量均明显降低，且通过尾静脉注射具有肺靶向的miR-143壳聚糖纳米球悬液可抑制骨肉瘤向肺部转移；另外miR-143的过表达可导致靶蛋白ASAP3和MSI2在体内外的减少。这些结果提示，miR-143对骨肉瘤侵袭性的抑制可能与ASAP3和MIS2基因表达的下调有关，但ASAP3和MIS2过表达是否会增强骨肉瘤的侵袭与转移能力仍需进一步研究。

5 miR-143与骨肉瘤耐药

骨肉瘤细胞的耐药性与miR-143低表达相关。在对多柔比星抵抗的骨肉瘤细胞系中过表达miR-143，可以降低ATG2B及LC3-Ⅱ的表达而增加Bcl-2的表达，导致细胞凋亡增加，细胞存活能力下降，进而逆转了化疗抵抗[14]。大蒜素能抑制骨肉瘤增殖、转移和与血管生成，同时发现可上调骨肉瘤细胞中miR-143表达[32]。有研究表明[33]，异丙酚的抗骨肉瘤作用部分是通过上调miR-143表达而抑制MMP-13表达来实现的。低剂量顺铂条件处理MG-63细胞后，细胞增殖率降低且miR-143的表达增加[34]。总之，这些数据支持了miR-143的肿瘤抑制功能，并建议使用合成的miR-143寡核苷酸或增加miR-143表达的药物，纳入骨肉瘤发病机制的相关研究。

6 展望

骨肉瘤的增殖、凋亡以及侵袭和转移等生物学效应的调控与miR-143密切相关。比如miR-143抑制骨肉瘤细胞增殖与其负向调控的K-ras、VCAN等基因的表达有关，而miR-143调控细胞凋亡的效应与Bcl-2表达水平密切相关。另miR-143对骨肉瘤的侵袭和转移的影响与下游的MMPs、MAPK、PAI-1等基因的表达水平是分不开的，且它们的表达水平均与miR-143呈负相关。但miR-143与骨肉瘤的关系的研究较少，特别是体内实验更为缺乏。因此，过表达体内miR-143的表达对骨肉瘤的作用效果以及miR-143逆转骨肉瘤化疗抵抗的效果并不明朗，这有待大量的研究阐明。

在如今的医疗环境下，miR-143作为一种新的生物学标志，有着独特的优势。若能进一步探究具有预后标志物潜能的miR-143与骨肉瘤发病之间的调控关系，那么针对miR-143的调节以及针对相应靶点的调节将会为骨肉瘤的靶向治疗开辟新的方向。