长链非编码RNA DANCR在神经胶质瘤中的表达水平和临床意义

杜金龙

(咸宁市中心医院,湖北科技学院附属第一医院重症医学科,咸宁 437100)

神经胶质瘤是恶性程度最高的中枢神经系统原发肿瘤,约占颅内肿瘤的46%,因其病程短,易复发,故彻底治疗较为困难[1,2]。虽然目前已经有手术切除治疗、放疗化疗、神经导航等治疗方式,但因瘤体增殖迅速、瘤细胞呈浸润性生长、肿瘤组织有较高的侵袭能力且与正常组织界限不清,故关于胶质瘤的治疗效果并不理想[3,4]。肿瘤的病变位置复杂,病人术后复发率较高,患者预后较差[5-7]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类碱基长度大于200 bp的RNA,之前被认为是RNA转录中的副产物,不具有生物学活性[8]。但是近些年来的研究发现,在某些肿瘤组织中,一些lncRNA的表达水平会出现异常,这些异常表达的lncRNA可影响细胞的一些重要的生物学过程如转录、增殖、凋亡以及分化等,这提示这些RNA可能可以作为早期诊断肿瘤的潜在生物标志物以及治疗靶点[9-11]。先前的研究证实,lncRNA-DANCR的表达可能在胃癌[12]、成视网膜细胞瘤[13]、神经胶质瘤[14]等肿瘤的发生和发展过程中发挥关键作用。但是目前,关于DANCR在脑神经胶质瘤中的表达情况以及与患者临床病理特征的相关性仍无明确研究结果。因此本研究通过检测DANCR在不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中的不同表达情况,分析其与胶质瘤患者各临床病理特征的相关程度以及与患者术后预后的关系,明确其临床意义,探讨其作为早期预测胶质瘤的生物学标记物的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究统计了咸宁市中心医院自2013-01～2018-01收治的52例神经胶质瘤患者手术切除的肿瘤组织标本以及患者的临床相关病理资料,入选患者术前均未接受放化疗或者其他抗癌治疗,所有病例均为首次手术治疗并且具有连续5年内同步更新的随访资料。其中所选病例有男性30例,女性22例,年龄在26-77岁范围内,平均年龄为56岁。此外统计了患者的肿瘤大小、肿瘤数目、KPS评分以及是否发生复发情况。按照WHO(2007年)神经系统肿瘤分类的标准对以上肿瘤组织进行组织学分级:Ⅰ级8例,Ⅱ级12例,Ⅲ级20例,Ⅳ级12例。此外有23例正常脑组织标本取自因颅脑损伤进行颅内减压术的患者。从手术之日起每3个月对该胶质瘤患者进行一次预后随访。随访方式为入院复查或者电话通话等,患者随访资料进行同步更新,随访截止日期为2018年1月。本研究被咸宁市中心医院伦理委员会准许,所有患者术前均签署知情同意书。

1.2 实验方法

将收集的胶质瘤组织标本和正常脑组织标本首先进行脱蜡处理,接着采用Trizol法提取组织标本中的总RNA(Invitrogen,CA,USA),然后采用紫外分光光度计测定组织标本在波长为260 nm以及280 nm处的吸光度比值,并计算OD260/OD280,选择OD比值在1.8-2.1范围内的总RNA作为样本。将RNA样品逆转录为cDNA后应用RT-PCR法分别检测神经胶质瘤组织和正常脑组织标本中DANCR的表达水平,内参设置为GAPDH。引物序列如下:DANCR上游引物正向:5′-GCCACTATGTAG-AGGGTTTC-3′;下游引物反向:5′-ACCTGCGCTAAGAACTGAGG-3′。GAPDH上游引物正向:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′;下游引物反向:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用2-ΔΔCt法对测得的数据进行相对定量分析,所有实验至少重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 神经胶质瘤组织中DANCR表达水平明显增高

RT-PCR的实验检测结果显示,与正常脑组织相比,神经胶质瘤组织中DANCR的表达水平明显增高(1.00±0.22vs3.06±0.28,P<0.001)。同时级别高(Ⅲ-Ⅳ级)的胶质瘤患者组织中的DANCR的表达水平(3.71±0.40)明显高于级别低(Ⅰ-Ⅱ级)的胶质瘤组织(2.41±0.22),这提示DANCR的表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关(P=0.013,见图1)。

2.2 DANCR表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的相关性

以DANCR在所有胶质瘤病理组织样本中平均表达水平(3.06±0.28)为界,将入选患者分为DANCR低表达组(21例,DANCR表达水平低于平均值)和DANCR高表达组(31例,DANCR表达水平高于平均值)。然后分析DANCR的表达水平与临床病理指标的相关性,结果显示:神经胶质瘤组织中高表达水平的DANCR与高病理分级(P<0.001)、低KPS评分(P=0.001)以及患者术后复发(P=0.004)有密切关系,而与患者的年龄(P=0.695)、性别(P=0.947)、肿瘤大小(P=0.523)以及肿瘤数目(P=0.463)等均无关(见表1)。

2.3 DANCR的表达水平与胶质瘤患者临床预后的关系

用Kaplan-Meier绘制DANCR低表达组和高表达组的患者术后5年生存率曲线并进行Log-rank检验,结果显示,神经胶质瘤组织中DANCR高表达组的患者预后和低表达组相比明显较差,患者术后5年生存期大大缩短,差异具有统计学意义(P=0.012,见图2)。

与正常脑组织比较,***P<0.001 与Ⅰ-Ⅱ级比较，**P<0.01 A.神经胶质瘤组织中DANCR的表达 B.不同级别胶质瘤患者组织中的DANCR的表达图1 LncRNA-DANCR在正常脑组织和神经胶质瘤组织中的表达水平Figure 1 Expression levels of lncRNA-DANCR in normal brain tissues and glioma tissues

表1lncRNA-DANCR表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的相关性

Table1CorrelationbetweenlncRNA-DANCRexpressionlevelsandclinicopathologicalcharacteristicsofgliomapatients

临床特征分层亚组nDANCR低表达(n=21)DANCR高表达(n=31)χ2P年龄0.1540.695 <50岁281216 ≥50岁24915性别0.0040.947 男301218 女22913病理分级21.185<0.001 Ⅰ-Ⅱ级20164 Ⅲ-Ⅳ级32527KPS评分10.5640.002 ≥80分23158 <80分29623术后复发8.1790.008 是32824 否20137肿瘤直径0.4070.523 <4 cm221012 ≥4 cm301119肿瘤个数0.5380.573 单个291316 多个23815

图2 lncRNA-DANCR高表达组和低表达组患者术后生存率的比较Figure 2 Comparison of postoperative survival rates of patients between lncRNA-DANCR high-expression group and low-expression group

表2胶质瘤患者不同临床病理因素与生存率的单因素分析结果

Table2Univariateanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

临床病理特征HR(95% CI)P年龄(<50岁 vs ≥50岁)1.231(0.694-2.146)0.405性别(男vs女)1.092(0.601-1.857)0.572KPS评分(<80 vs ≥80)2.105(1.241-3.922)0.019病理分级(Ⅰ-Ⅱ级vsⅢ-Ⅳ级)1.984(1.187-3.568)0.022术后复发(是vs否)2.463(1.445-4.525)0.010肿瘤大小(<4 cm vs ≥4 cm)1.484(0.804-2.627)0.283肿瘤数目(单个vs多个)1.129(0.646-1.921)0.502DANCR表达水平(低vs高)2.734(1.526-5.171)0.002

将各患者临床病理指标与生存率进行了单因素分析,结果见表2。而后将单因素分析中具有统计学意义的病理指标进行多因素COX比例风险回归分析。分析结果显示:高表达水平的DANCR、高病理级别、KPS评分<80分以及术后复发均为影响胶质瘤患者临床预后的独立危险因素(见表3)。

表3胶质瘤患者不同临床病理因素与生存率的多因素分析结果

Table3MultivariateCoxregressionanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

临床病理特征HR(95% CI)PKPS评分(<80 vs ≥80)2.421(1.417-4.439)0.011病理分级(Ⅰ-Ⅱ级vsⅢ-Ⅳ级)2.259(1.384-4.151)0.017术后复发(是vs否)2.815(1.762-5.322)0.001DANCR表达水平(低vs高)2.982(1.829-5.507)<0.001

3 讨论

神经胶质瘤是一种常见的恶性程度最高的中枢神经系统原发肿瘤,具有极强的侵袭性和无限增殖的特点,并且在组织中呈浸润性生长。与正常组织之间的界限不清楚使得手术中很难将其完全切除,继而残留的肿瘤细胞会再次增殖,导致患者术后极易复发,临床预后较差[15]。目前,在有关神经胶质瘤的临床诊疗中仍然缺少可靠的可预测胶质瘤患者预后的生物学标志物。虽然大量的研究已经证实胶质瘤患者的预后与WHO分级、KPS评分等因素有关,但是由于患者自身的差异性和肿瘤的复杂性,这些因素并不能达到精确评估的要求[16,17]。因此本课题组进行了一系列相关研究,目的在于寻找一种可提前诊断胶质瘤并且可以准确预测胶质瘤患者术后预后的生物学标志物,从而为神经胶质瘤的早期诊断、临床治疗以及判断预后提供实验证实和新手段。

近些年来,越来越多的研究发现,在某些肿瘤组织中,lncRNA的表达水平会出现异常,而这些异常表达的lncRNA可影响肿瘤细胞发生发展过程中多个关键环节[18]。同时有研究证实,lncRNA与细胞生物学特征密切相关,可通过调节信号传导通路促进细胞癌变并影响肿瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭能力等,这提示其可能作为肿瘤发生潜在的生物学标志物以及治疗靶点[19]。例如,Zhao等[20]的研究发现lncRNA-HOTAIR在乳腺癌中作为促癌基因,其表达水平在乳腺癌组织和细胞中显著升高,抑制癌细胞中lncRNA-HOTAIR的表达,可通过调节microRNA-20a-5p/HMGA2通路,明显抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且促进肿瘤细胞的凋亡。Yang等[21]证实lncRNA-MAGI2-AS3在乳腺癌中作为抑癌基因,其表达水平在乳腺癌组织中显著降低,可明显抑制肿瘤细胞的增殖能力。DANCR(differentiation antagonizing non-coding RNA,反分化长链非编码RNA)作为lncRNA家族中的一员,已被证实在多种类型的恶性肿瘤发生发展过程中发挥重要的调节作用。例如,有研究报道,DANCR在非小细胞性肺癌组织和细胞中的表达显著升高,DANCR可促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[22]。也有研究证实其在胶质瘤中的调节作用,Li等[23]证实,DANCR在胶质瘤组织和细胞中的表达水平呈异常升高趋势,过表达的DANCR可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进胶质瘤的恶性进展。然而,DANCR在预测胶质瘤患者临床预后的作用却没有研究报道。因此,本研究探讨了不同表达水平的DANCR与胶质瘤患者的临床病理特征以及预后之间的相关性。

在研究中,我们首先应用RT-PCR技术检测了DANCR在神经胶质瘤组织和正常脑组织中的表达水平,分析统计结果,我们发现在神经胶质瘤组织中DANCR的表达水平明显低于正常脑组织,且表达量随着胶质瘤恶性程度的升高而增高。然后,我们进一步分析了DANCR的表达水平与神经胶质瘤患者各临床病理指标的相关性,结果显示:神经胶质瘤组织中高表达水平的DANCR与肿瘤的高病理分级、低KPS评分以及患者术后复发有密切关系,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小以及肿瘤数目等均无关。最后,我们探讨了DANCR的表达水平以及病理分级、KPS评分等因素与胶质瘤患者临床预后的关系。根据我们同步更新的随访数据可知,DANCR高表达组患者的术后5年生存率明显低于DANCR低表达组。同时我们的研究证实高表达水平的DANCR、高病理级别、KPS评分<80分以及术后复发均与胶质瘤患者临床预后情况密切相关,都可作为预测患者预后的指标。

综上所述,本研究中我们证实了DANCR在神经胶质瘤组织中的表达水平显著增高,而高表达水平的DANCR与胶质瘤患者的不良临床预后有关,可作为预测胶质瘤患者术后预后的独立因素。然而DANCR在神经胶质瘤发生发展过程中的具体作用机制,以及可能涉及到的更多靶基因和信号传导通路目前尚不能得出结论,这将是我们团队下一步的研究方向和重点。