黄芩不同洗脱部位化学成分分析及抗衰老活性研究

朱十伟,薛立英,高 丽,秦雪梅,杜冠华,,周玉枝*

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西大学化学化工学院;3中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所;*通讯作者,E-mail:zhouyuzhi@sxu.edu.cn)

衰老是机体各器官功能退行性下降的必然过程。随着年龄的增长,机体对抗外界压力的能力降低,致使与衰老相关的疾病发生率普遍升高,如:阿尔茨海默病、帕金森症、心脑血管疾病、糖尿病和癌症等。中药黄芩为唇形科植物,以根入药。黄芩中含有黄酮类、挥发油、萜类和多糖等多种化学成分[1],其中黄酮类化合物和多糖是黄芩发挥药理作用的主要成分。本课题组前期研究报道了黄芩乙醇提取物能够改善D-gal致大鼠衰老模型中模型大鼠的学习记忆功能,延缓果蝇衰老[2,3]。另有研究报道,黄芩水提物能够提高快速老化小鼠P/8的抗氧化能力和免疫功能[4];黄芩茎叶总黄酮能够提高铝毒衰老模型小鼠的记忆能力和修复自由基功能异常[5]。另外,黄芩中的单体成分黄芩苷和黄芩素也具有提高衰老大鼠学习记忆的能力[6,7]。虽然黄芩粗提物和某些单体已被证实具有抗衰老活性,但目前黄芩中的抗衰老有效部位尚不明确,黄芩抗衰老有效部位的研究将为探究其抗衰老物质基础研究提供依据。本研究尝试将黄芩醇提物分离,富集不同部位成分,进而对各部位成分进行抗衰老活性评价,为后期抗衰老活性成分的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型黑腹果蝇W1118品系(山西大学应用生物学研究所)。

1.2 黄芩及主要试剂

黄芩(山西省晋城市陵川县),经山西大学中医药现代研究中心主任秦雪梅教授鉴定为《中国药典》2015版所收录的正品黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi);HPD100大孔吸附树脂购自天津浩聚树脂科技有限公司;分析纯的无水乙醇、蔗糖和丙酸均购自天津市风船化学试剂科技有限公司;标准品:黄芩苷(质量分数≥98%),汉黄芩苷(质量分数≥98%),黄芩素(质量分数≥98%)和汉黄芩素(质量分数≥98%)购自中国科学院成都生物研究所;玉米粉(市售);琼脂(分析纯)购自北京索莱宝科技有限公司;酵母粉(食品级)购自安琪酵母股份有限公司。

1.3 主要仪器

旋转蒸发仪,德国艾卡集团;冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;Thermo BDS Hypersil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱,美国赛默飞公司;果蝇培养管,北京中创宏达科技有限公司;MGC-350HP-2人工气候箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.4 黄芩不同分离部位的制备

1.4.1 黄芩醇提物的制备 本实验采用前期课题组建立的黄芩提取优化工艺[8]。将黄芩粉碎得中粉,加入10倍量的70%乙醇,80 ℃回流提取1.5 h,过滤,重复提取2次,合并滤液,减压浓缩,冷冻干燥,得黄芩醇提物干样品。

1.4.2 大孔树脂预处理 95%乙醇浸泡HPD100大孔吸附树脂24 h。采用湿法装柱,90%乙醇冲洗色谱柱,直至流出液与水1 ∶5混合后无浑浊,最后水洗至无醇味。

1.4.3 洗脱 将1.4.1得到的黄芩醇提物干样品的水溶液加入大孔树脂柱,分别以水、50%乙醇和95%乙醇作为洗脱溶剂,以流速3 BV/h进行洗脱,每个梯度收集3 BV。

1.4.4 浓缩与干燥 将1.4.2得到的洗脱液进行减压浓缩后,分别将浓缩液冷冻干燥得到水、50%乙醇和95%乙醇洗脱部位干燥产物,计算出膏率,出膏率=各部位产量(g)/干样品上样量(g)×100%。

1.5 黄芩不同洗脱部位主要化学成分定性分析

1.5.1 色谱条件 色谱柱:Thermo BDS Hypersil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱;检测器:紫外检测器;流动相:以0.4%的磷酸水溶液为流动相A,以甲醇为流动相B,在波长277 nm处按表1的条件进行梯度洗脱[8]。

表1梯度洗脱条件

Table1Gradientelutionconditions

时间(min)流动相A(%)流动相B(%)流速(ml/min)05347110257511501001200100122534712753471

1.5.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素适量,加甲醇分别制成每1 ml含黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素各62.3,224,39.96,435.2 μg的对照品储备液。

1.5.3 供试品溶液的制备 各精密称取1.4.4中得到的三种不同洗脱部位冷冻干燥后的干粉适量,置10 ml容量瓶中,分别加入水,50%乙醇,95%乙醇至刻度,摇匀,即得。

1.6 培养基的制备

将浓度分别为10,85,70和18 g/L的琼脂、玉米粉、蔗糖和酵母粉加蒸馏水煮沸,加入0.5%的丙酸配制成空白培养基。在空白培养基中分别添加浓度为0.15 mg/ml和3 mg/ml的水分离部位、50%乙醇分离部位和95%乙醇分离部位制备成含药培养基。将空白和含药培养基倒入相应的果蝇培养管中,每管5 ml,用于实验。

1.7 黄芩不同分离部位对自然衰老果蝇寿命的影响

1.7.1 给药剂量的设置 本课题组前期研究发现0.04,0.2和1 mg/ml的黄芩素均能够延长雄性果蝇寿命,本实验通过含量测定得到95%乙醇洗脱部位含有29.4%的黄芩素。通过换算,使95%乙醇洗脱部位低、高两个剂量组分别含有约0.04和1 mg/ml的黄芩素,换算后的低、高给药浓度约为0.15 mg/ml和3 mg/ml,为统一各部位的给药剂量,故以黄芩素低、高两个剂量为基准,使每个部位各设0.15 mg/ml和3 mg/ml两个给药浓度。

1.7.2 果蝇寿命实验 收集3 d内羽化的雄性果蝇成虫,随机分为7组:空白对照组、水洗脱部位0.15 mg/ml组和3 mg/ml组(Water-0.15,Water-3)、50%乙醇洗脱部位0.15 mg/ml组和3 mg/ml组(50% Ethanol-0.15,50% Ethanol-3)、95%乙醇洗脱部位0.15 mg/ml组和3 mg/ml组(95% Ethanol-0.15,95% Ethanol-3),每组200只,于温度25 ℃、湿度65%的恒温恒湿自然光律交替的智能气候箱中培养,每3 d更换相应的培养基。每日记录果蝇的死亡数量,直至全部死亡,绘制生存曲线,计算平均、中位和最长寿命。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 黄芩不同洗脱部位的出膏率

黄芩各洗脱部位出膏率计算方法如1.4.4所述,黄芩乙醇提取物的水洗脱部位出膏率为39.96%,50%乙醇洗脱部位出膏率为45.6%,95%乙醇洗脱部位的出膏率为4.42%。

2.2 黄芩不同洗脱部位主要化学成分定性分析结果

图1 标准品HPLC图Figure 1 HPLC chromatogram of standard compounds

图2 黄芩不同洗脱部位HPLC图Figure 2 HPLC chromatogram of different eluting fractions of Scutellaria baicalensis Georgi

根据图1中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的对照品HPLC色谱图,对图2中黄芩各洗脱部位HPLC色谱图进行指认,结果显示,黄芩水洗脱部位的主要成分在紫外检测器下基本无吸收,黄芩50%乙醇洗脱部位的主要成分为黄芩苷和汉黄芩苷,黄芩95%乙醇洗脱部位的主要成分为黄芩素和汉黄芩素。

2.3 黄芩不同洗脱部位对自然衰老果蝇寿命的影响

对空白对照组和黄芩不同分离部位给药组的所有果蝇生存率进行统计分析,结果显示,与空白对照组相比,给予果蝇3 mg/ml水洗脱部位、0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脱部位均能显著延长果蝇的整体存活率。其中3 mg/ml水洗脱部位、0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脱部位分别能提高果蝇平均寿命8.4%,8.6%和8.4%(P<0.001,见图3);0.15 mg/ml和3 mg/ml 50%乙醇洗脱部位分别能提高果蝇最高寿命3.4%(P<0.01)和2.8%(P<0.05,见表2)。

3 讨论

目前中药抗衰老有效成分的研究多集中于黄酮和多糖类成分。常小平等[9]对不同产地黄芩中黄酮类成分的含量进行测定,发现各产地黄芩总黄酮含量均大于20.11%,黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量分别大于10.98%,3.95%,1.05%,1.31%;石俊英等[10]对不同产地黄芩中多糖的含量进行测定,发现各地黄芩粗多糖的含量均大于6.46%,总糖含量大于16.3%。本研究中HPLC色谱图显示,水分离部位中主要成分的紫外吸收较弱,应主要为多糖类成分,50%乙醇部位中的主成分为黄芩苷和汉黄芩苷,95%乙醇部位中的主成分为黄芩素和汉黄芩素,这为考察这三个洗脱部位的抗衰老活性提供了物质基础。药效学实验结果显示黄芩水分离部位和50%乙醇洗脱部位能够延长果蝇寿命,证实了黄芩多糖和黄酮类化合物具有延缓衰老的作用。课题组前期研究发现黄芩素具有抗衰老的活性[11],另外文献报道汉黄芩素具有抗氧化、神经保护和改善AD症状的作用[12-14]。而本研究结果显示,黄芩95%乙醇分离部位未表现出延长果蝇寿命的作用,且在3 mg/ml的浓度下还表现出缩短寿命的趋势,推测导致这种结果的原因如下:其一,黄芩95%乙醇洗脱部位不易溶于水,使配制的培养基中药物分布不均匀,造成给药不均匀。其二,黄芩黄酮类成分虽然药理活性广泛,但摄入量过高也会引起一定的毒副作用。Li等[15]通过细胞毒性试验证明了四种主要的黄酮类成分中黄芩苷的毒性最小,汉黄芩素的毒性最大。这是因为黄芩苷和汉黄芩苷位点7上的D-吡喃葡糖苷糖醛酸对减小药物毒性具有重要作用,而黄芩素和汉黄芩素的位点7上是羟基。因此当黄芩素和汉黄芩素富集到一起给药可能会加大毒性,并且给药浓度过大使这种毒性表现出来,引起果蝇生存率降低。其三,在设置给药剂量时,仅以黄芩素为基准进行换算,未考虑汉黄芩素,这使得给药浓度的设置存在偏差。后期课题组将会改变黄芩95%乙醇分离部位的溶媒及给药剂量重新考察其抗衰老作用。

图3 黄芩不同洗脱部位对自然衰老果蝇模型寿命的影响Figure 3 Effect of different eluting fractions of Scutellaria baicalensis Georgi on life-span of natural aging Drosophila melanogaster

表2黄芩不同洗脱部位对自然衰老果蝇模型寿命的影响

Table2EffectsofdifferentelutingfractionsofScutellariabaicalensisGeorgionlifespanofnaturalagingDrosophilamelanogaster

分组平均寿命(d)中间寿命(d)P(时序检验)最大寿命(d)空白组50.0±0.952.0±0.8-67.6±0.6水-0.15 mg/ml51.6±0.854.0±1.10.19068.9±0.7水-3 mg/ml54.2±0.8∗∗∗54.0±1.9<0.00168.7±0.350%乙醇-0.15 mg/ml54.3±0.8∗∗∗56.0±1.2<0.00169.9±0.4∗∗50%乙醇-3 mg/ml54.2±0.8∗∗∗56.0±1.3<0.00169.5±0.5∗95%乙醇-0.15 mg/ml51.6±0.951.0±1.00.33668.1±0.595%乙醇-3 mg/ml49.2±0.849.0±0.90.19267.4±0.6

与空白组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001