胚胎植入前基因检测技术的研究进展和思考▲

杨 华 吴 卓 李春苑 陈自洪 邹 彦 邓志华 韦永全 曾建伟 廖维芳 谭庆英 梁新红 黄柳静 丘 映 许常龙

(南宁市第二人民医院生殖医学中心，广西南宁市 530031，电子邮箱：85308539@qq.com)

【提要】 胚胎植入前基因筛查和植入前遗传学诊断能够帮助检测胚胎的整倍性，并检测其是否携带遗传病致病基因，从而筛选出更为健康的胚胎以提高妊娠率。将早期的活检技术结合近些年研发出的新一代分子生物学检测技术，使得胚胎植入前基因检测技术具有更高的精确度以及更优的时效性。本文针对胚胎植入前基因检测技术的研究现状进行综述，并从社会和人文角度对该技术的应用进行展望和思考。

在我国，由出生缺陷问题所导致的围产儿和婴儿死亡的现象较为常见，即便患儿能够存活，由缺陷带来的残疾和其他问题也严重影响患儿的生活质量，给家庭成员带来巨大的心理负担和精神压力。单基因遗传病是造成新生儿出生缺陷的主要疾病之一，指由基因组DNA上一个或一对等位基因突变所导致且符合孟德尔遗传规律的疾病，包括显性遗传、隐性遗传及X-连锁遗传等多种遗传类型。虽然单基因遗传病的单个病种发病率较低，但由于其病种繁多，所以在出生活婴中的总体发病率和人群中的总体患病率很高[1]。现代医学还不能改变已出生者的基因，绝大多数遗传病无法治愈，而且患者的致病基因会传递给子孙后代，解决这一问题的根本途径是进行出生前或胚胎移植前诊断，从而避免此类患儿出生。

胚胎植入前基因检测可以在胚胎移植入子宫之前，将其中的部分细胞取出进行植入前遗传学诊断或植入前遗传学筛查。胚胎植入前遗传学诊断能够较好地对已知缺陷进行检测，例如当父母一方携带有突变位点或基因重组时，能够检测到胚胎的特定位点突变或染色体重排；而胚胎植入前遗传学筛查则更广泛地应用于筛查染色体非整倍体现象，特别是高龄产妇以及习惯性流产患者。本文针对胚胎植入前基因检测的现行技术及新技术进行综述，并从社会和人文角度对该技术的应用进行展望和思考。

1 植入前基因检测的概述

自1978年首例应用体外受精技术的婴儿出生以来，为了不断提高受孕率，人们开发出各种辅助生殖技术，如胞浆内单精子注射技术以及胚胎低温保存技术等[2]。早期胚胎着床率和早孕率下降的主要原因是非整倍体比例的升高，研究表明，妊娠前3个月的流产中，非整倍体原因所致流产占50%[3]。因此，直接将整倍体胚胎移植入子宫能显著提高着床率并降低流产率，植入前基因检测应运而生。

植入前基因检测的受试者通常是经过检查后，有可能生育单基因缺陷风险婴儿的夫妇。植入前遗传学诊断通常对经由体外受精获得的胚胎进行活检，对胚胎中1个或多个细胞进行遗传学分析，并最终选择未受基因缺陷影响的胚胎进行移植。极体是卵母细胞两次减数分裂的副产物，其中包含着多余的母源染色体，因此可通过极体对母源单基因遗传缺陷进行检测。伴随着胚胎发育，还可以从卵裂阶段的胚胎到囊胚阶段的滋养外胚层细胞中取出1个或多个细胞进行活检。而成熟的胚胎玻璃化冷冻和快速解冻技术，不仅能够保证胚胎后续发育不受影响，还能对胚胎进行遗传诊断和筛查，使得囊胚期胚胎活检成为较为可靠的植入前基因检测手段。

有研究者将植入前基因检测细分为用于单基因疾病的胚胎植入前基因检测(用于染色体非整倍体的胚胎植入前基因检测)和用于染色体结构失衡的胚胎植入前基因检测[4]，这使得植入前基因检测的研究方向更为细致和深入。此外，植入前基因检测技术的发展也离不开微量DNA遗传和染色体分析技术发展，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，荧光原位杂交(flourescence in situ hybridization,FISH)，以及包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridisation,aCGH)以及“下一代”测序术(next-generation sequencing，NGS)等在内的微阵列技术。众多分子生物学方法论的发展也推动着植入前基因检测技术的快速成熟和稳定，使得检测结果准确度不断提高，检测范围和检测深度也迈上新的阶梯。

2 现行植入前基因检测技术的优势及劣势

2.1 极体活检 极体活检是指在胚胎卵裂前取出第1次及第2次减数分裂所排出的极体，并进行遗传学检测。1990年，学界首次报道了临床应用极体活检技术对胚胎发育进行评估，并且该项技术对后续的着床率和卵裂期的胚胎发育无负面影响[5]。极体活检通过取出极体对胚胎发育进行预测和评估，避免了从胚胎中取出细胞，具有一定的优势。但由于该技术仅能分析母源染色体或基因，而无法对父源遗传物质进行鉴定，因此具有一定的局限性。此外，极体活检从单个胚胎中所获取的遗传物质数量极少，并且限制因素较多，例如PCR检测过程中无法对等位基因进行评估，因此该项技术并未得到广泛应用。

2.2 卵裂期(囊胚)活检 胚胎细胞活检是指在胚胎卵裂期，自6细胞胚胎至8细胞胚胎中取出1～2个细胞进行活检。与极体活检相比，胚胎细胞活检可以同时分析母源和父源的遗传物质，检测范围更广。但由于遗传物质数量过少，相关检测受到了限制，如在卵裂期发生嵌合的概率高达60%[6-7]，而胚胎细胞活检对嵌合现象的检测准确性低等，因此容易产生误诊[8]。此外，在卵裂期取出个别细胞会延缓胚胎发育至囊胚期的时间，并可能由此导致着床率和受孕率下降[9-11]。

2.3 滋养外胚层活检 世界上首例应用滋养外胚层活检和囊胚期移植技术进行植入前基因检测的婴儿于2005年出生[12]。而随着培养体系的不断完善，囊胚期胚胎移植的受孕率显著提高[13-14]。此外，经SNP技术进行序列分析，证实内细胞团与滋养外胚层遗传特性高度一致[15]。因此，滋养外胚层活检随后被应用于临床试验中，并开始进行多细胞活检，大大减少了误差，保证了结果的准确性。尽管与卵裂期胚胎相比，囊胚期胚胎的嵌合率较低，但仍无法完全避免由嵌合引起的误差[16]，且多数生殖中心无法在同一个体外受精周期内完成胚胎活检、基因分析及移植[17]，因此在细胞被送往实验室进行活检分析期间，需要将囊胚进行冷冻保存，并在检测完成后挑选适宜的胚胎进行移植，这在一定程度上增加了难度和成本。

3 植入前基因检测新技术新方法的应用

早期的FISH是最先开始应用于囊胚活检的方法，其利用对有限数量的染色体进行评估检测，发现非整倍体现象[18-19]。而随着单细胞全基因组扩增技术的快速发展及应用，使得同时对人类24条染色体进行量化检测成为可能，即全染色体筛选技术。全染色体筛选技术包含SNP芯片技术、aCGH芯片技术、定量PCR技术和NGS技术。

3.1 SNP芯片技术 SNP芯片技术能够在给定物种范围内一次性大量检测基因组DNA的单核苷酸多态性差异。一次芯片分析通常情况下能够检测到基因组中大约30万个SNP位点，并通过与参考基因组对比，确定全部染色体范围内的非整倍体、约250种常见结构畸变以及单亲二倍体现象[19-20]。SNP芯片技术还可用于比较杂合位点上两等位基因间的差异，从而实现高分辨率和高重复性分子细胞遗传学检测[20]。但SNP芯片仍存在一定的局限性，如仅能检测5 Mb以下的染色体结构异常，无法检测平衡染色体重排，以及无法检测血亲夫妇的基因异常(SNP位点纯合)等[21-23]，而且从经济角度考量，SNP芯片也较为昂贵。

3.2 aCGH芯片技术与传统技术的比较 基因组杂交方法是将从囊胚中提取的DNA与正常对照组个体的DNA进行分离和荧光标记，并经过3～5 d的杂交后再进行分析比较。该技术随后被aCGH芯片技术所取代，1个aCGH芯片中包含3 000～4 000个人类DNA片段，分辨率高达10 Mb，可检测整条染色体以及大于10 Mb片段的非整倍体现象[20]。但aCGH芯片同样存在局限性，它会剪切所有的染色体以匹配非整倍体状态，而非染色体特异性剪切会产生假阳性结果。此外，由于可用于植入前基因筛查的DNA数量较少，会导致aCGH检测的错误率达到2%～5%，但针对滋养外胚层活检，应用aCGH技术仍能够保证较高的敏感性(99.8%)和特异性(99.6%)[24-25]。

3.3 定量PCR技术 定量PCR技术是一种能够快速鉴别24条染色体非整倍体的方法，在滋养外胚层活检分析中得到了较为广泛的应用[17，20]。该方法首先经过预扩增，随后通过多重PCR技术，使每条染色体的每条臂至少扩增得到两个序列。定量PCR的优势在于分析时间可缩短至4 h，能够在同一受精周期内进行活检和胚胎移植。并且通过对各条染色体进行特异性剪切，具有较高的诊断准确度(98.6%)[17，24]；而经由比较基因组杂交检测后，再使用定量PCR进行验证，对整倍体胚胎的诊断错误率可低至0.21%[26]。现行定量PCR技术的局限性在于还未在囊胚和极体活检样本上得到运用，且同时进行检测的样本数量较少，并且无法检测到片段性非整倍体[17，20]。

3.4 NGS技术 应用于植入前基因筛查的NGS技术包含全基因组DNA扩增建库，PCR扩增前准备，以及输入DNA的标记和片段化等[27]。应用NGS检测染色体非整倍体的灵敏度可达100%，特异性可达99.98%[28]。同时经过aCGH和NGS检测后，移植的整倍体囊胚临床妊娠率和着床率分别达到63.8%和62.0%[27]。与aCGH技术相比，NGS成本较低，能够同时对多样本进行检测，自动化程度极高，并且能够对部分非整倍体和嵌合现象进行检测。尽管NGS技术较为强大，但仍存在局限性，例如无法检测到平衡染色体易位，以及由全基因组DNA扩增引起的片段性非整倍体现象。

3.5 核型定位技术 核型定位技术应用全基因组连锁分析对夫妇双方及已知遗传性状家庭成员间的SNP进行比对，以确定等位基因SNP位点与携突变染色体间的关联性[29]。核型定位技术无须等待家族特定候选基因探针的开发(3～4个月)，直接经全基因组扩增和基因分型，构建核型库，随即将胚胎基因型与参考基因组进行比较，由此确定是否受到亲本携突变遗传的影响[30]。与PCR扩增相比，该技术成本较高，但由于时间短、自动化程度高，因而其运行成本与PCR差距不大[23]。

4 地区差异性与需求带来的思考

我国幅员辽阔，人口基数巨大，遗传性疾病的发病绝对人数极高，因此通过植入前基因检测技术对植入前胚胎进行遗传学检测，对预防遗传病，提高人口素质和国计民生具有重大意义。由于社会的快速发展和自然环境的不断变化，近年来，各类遗传病发病率呈现上升态势，应用植入前基因检测技术，能够为有家族遗传病史的夫妇提供临床筛查服务，减少及阻断单基因遗传病的发生和世代遗传，实现在基因层面上预防遗传性疾病，对提高我国公共卫生水平具有重要意义。

自1990年第1例植入前基因检测婴儿成功诞生以来，该技术在公众和学术领域一直存在争议。来自医学、社会科学及人文科学界的人士认为植入前基因检测是人类优生的一种新形式，通过对植入前胚胎进行检测和选择，提供了一种超越产前诊断后终止妊娠的选择机会。但另一部分学者认为，与20世纪的优生学不同，植入前基因检测技术的应用与人类发展进程无关，更多的只是对个体及家庭因遗传病所致痛苦的预防。在欧洲部分国家，监管机构对植入前基因检测技术的应用进行了极为严格的管理，对受试夫妇的年龄、遗传病史、意向等进行了严格的筛选[31-32]，意在应用植入前基因检测技术帮助真正受遗传病困扰的家庭，而非想借助该技术达成其个人目的和意愿的家庭，尤其是意在进行性别选择的家庭。但这些人文伦理层面的筛选和甄别难度较大，且主观性较高，在实际从业过程中具有较高的不可控性。

另一方面，地区发展水平的差异及由此带来的经济条件差异，也为植入前基因检测技术的应用及初衷带来了思考。与其他诊疗方法一样，植入前基因检测为受到遗传疾病困扰的人群提供解决方案，能够让后代免受遗传病困扰，但同时其高昂的检测费用也成为其推广应用的障碍之一。在美国，大多数医疗保险公司都不会承担植入前基因检测的费用。美国研究者在对遗传病风险较高的18对夫妇进行访谈时发现，大多数夫妇表示植入前基因检测的成本问题是最大的障碍[33]。有研究者在澳大利亚对50位接受植入前基因检测的女性进行采访时也发现，过高的检测费用令接受检测者担忧，而其家庭收入均已高于当地平均水平[34]，但在地中海贫血高发国家(如沙特阿拉伯和伊朗等)，已对婚前育龄人群实行强制性的遗传学筛查，以控制该遗传病的发病。

针对上述两方面的问题，在依靠社会和公众力量，普及生殖知识，推广优生优育理念的同时，也要推动立法，将重大遗传缺陷的筛查和植入前基因检测列入国家医疗保险，为经济欠发达地区和遗传病高发地区人民提供更多的优生优育选择，为提高我国公共医疗卫生水平提供保障。

5 结 语

植入前基因检测很大程度上扩展了体外受精和不孕不育的治疗范围，在解决生育问题的同时，能够实现生育质量的提高，可以使胚胎不受双亲携带的遗传病以及非整倍体所带来的困扰。相较于非整倍体和嵌合体胚胎，整倍体胚胎着床率和妊娠率均较高，因此，该技术的应用也在一定程度上提高了生育率，保证了生育质量。结合植入前基因检测和产前筛查诊断，能够有效减少由遗传病和非整倍体所导致的新生患儿缺陷和死亡的现象。

随着技术水平的不断提升，用于植入前基因检测的遗传学诊断方法也不断扩展，针对不同的检测需求，人们有了更多的选择。相关技术的革新发展和生殖医学研究的不断深入，使得植入前基因筛查和植入前基因诊断的应用进一步扩大和深入，将为患者提供更高的诊断精确度。而伴随国家经济发展和区域协同发展的不断扩展，地区经济差异将进一步缩小，将来能够为更多受遗传病困扰的家庭提供经济上的便利。