胎盘外泌体在子宫螺旋动脉重铸不全相关妊娠并发症中的作用

徐欣然，王妍平，崔洪艳

外泌体（exosomes）是细胞主动分泌的直径40～ 100 nm的囊泡，是细胞间通讯的关键分子，细胞将多种分子内容物包裹入外泌体，如蛋白质、脂质、mRNA、微小 RNA（miRNA）等[1]，并通过这些内容物作用于靶细胞。外泌体的发现更新了细胞间信息的传递途径。胎盘来源的外泌体与其他细胞来源的外泌体相较，不同之处在于其特异性地表达耐热碱性磷酸酶（PLAP）、人白细胞抗原 G（HLA-G）和人 19号染色体miRNA族（C19MC）[2]。早在妊娠6周，胎盘滋养细胞就向母体血循环中释放外泌体，且外泌体在母血中的浓度随孕周增加而增加。胎盘外泌体代表了胎盘滋养细胞与母体细胞作用的另一通路，促进母体对妊娠的适应性改变。在螺旋动脉重铸不全相关妊娠并发症中，胎盘外泌体也可能会发生浓度和功能的变化。

1 外泌体概述

外泌体具有类似于细胞膜的脂质双分子层结构。在蔗糖溶液中位于1.13～1.19 g/mL密度层。外泌体在透射电镜下是杯状的，在体液中呈球形，可由多种细胞分泌，如红细胞、上皮细胞、内皮细胞、树突细胞、淋巴细胞、胎盘细胞等。大多数体液中可以检测到外泌体，如血液、尿液、羊水和乳汁等[1]。

不同细胞来源的外泌体具有共同的蛋白质与RNA组分。具有参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤生长等作用。很多研究证实，外泌体是细胞间通讯的关键分子。蛋白质组分主要包括膜转运与融合相关蛋白[小G蛋白（RabGTPases）、膜联蛋白（Annexins）、脂阀结构蛋白（Flotillin）等]，多囊泡胞内体产生的相关蛋白 [多囊泡核内体蛋白（Alix）、肿瘤易感基因 101蛋白（TSG101）等]，分子伴侣[热休克蛋白 70（HSP70）、HSP90 等]，整合素，四次跨膜蛋白（CD63、CD9、CD81、CD82等）。RNA 组分主要包括mRNA（在受体细胞中翻译出相应的蛋白质），miRNA（通过降解或抑制mRNA的翻译来调控蛋白质在靶细胞中的表达），小干扰RNA（siRNA，敲除靶细胞中的目标基因，达到基因沉默的作用）。外泌体作用于靶细胞的方式有3种，一是直接激活靶细胞表面受体，二是影响靶细胞外环境，三是直接进入靶细胞内部释放活性物质[3]。

外泌体携带的多种分子能够反映其来源细胞的生理状态和功能状态，可用于疾病诊断。而且，外泌体作为一种细胞间信息传递的运输工具，能够达到临近或远处细胞的细胞间隙，调节靶细胞生物活性，因此可以作为药物的纳米载体对异常细胞进行治疗[4-5]。

2 胎盘外泌体

2.1 胎盘外泌体的组成胎盘滋养层细胞均可分泌外泌体，其中绒毛外滋养层细胞（EVT）是胎盘锚定的基础，是子宫螺旋动脉重铸以及防止母体对同种异体胚胎和胎盘组织产生免疫攻击的关键细胞，所以目前胎盘外泌体的基础研究主要集中在EVT。妊娠早期，EVT形成栓子堵塞螺旋动脉与母体循环直接接触，在妊娠9～11周解除堵塞开始螺旋动脉重铸，至妊娠18～20周重铸完成。这期间与母血直接接触的胎盘细胞主要为EVT，所以在妊娠早中期母体循环中的胎盘外泌体主要来源于EVT[6-7]。为了促进母体免疫耐受，EVT特异性表达HLA-G，可作为蜕膜自然杀伤（dNK）细胞表达的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）的配体，以免被dNK细胞杀伤。用HLA-G抗体通过蛋白质印迹（Western blotting）可以确定待检测的外泌体是否为EVT来源[8]。

妊娠中期螺旋动脉重铸完成后，主要由合体滋养细胞执行胎盘功能，包括物质交换，合成维持妊娠的激素，胎盘屏障和免疫耐受等。合体滋养细胞在绒毛间隙与母血充分接触，PLAP是合体滋养细胞特异性产生的，在非妊娠妇女血浆中无法检测出PLAP[9]。合体滋养细胞产生的外泌体也特异性表达PLAP，用PLAP抗体通过Western blotting可以确定待检测的外泌体是否为合体滋养细胞来源。

2.2 胎盘外泌体的功能

2.2.1 胎盘外泌体在子宫螺旋动脉重铸中的作用 由于EVT的主要功能是重铸子宫螺旋动脉，所以其外泌体的主要靶细胞为螺旋动脉内皮细胞、血管平滑肌细胞和母体免疫细胞。在正常妊娠过程中，EVT与母体细胞的联系是外泌体介导的，而且外泌体的作用是氧浓度依赖的[10]。

有研究用HTR-8/SVneo细胞作为EVT模型，在8%的氧浓度下（模拟生理环境）培养该细胞释放的外泌体具有促进人脐静脉内皮细胞迁移，从而促进血管形成的作用；而在1%的氧浓度下（模拟子痫前期环境）培养该细胞释放的外泌体具有抑制人脐静脉内皮细胞迁移的作用，而且诱导内皮细胞释放更多的肿瘤坏死因子α（TNF-α）。有研究表明低浓度的TNF-α促进滋养细胞增殖，而高浓度的TNF-α抑制滋养细胞增殖并促进其凋亡，抑制血管内皮细胞的迁移，影响血管形成[11]。表明低氧条件下EVT分泌的外泌体不利于子宫螺旋动脉重铸。

子宫螺旋动脉重铸过程中血管平滑肌细胞（VSMCs）消失，由纤维蛋白组织取代，凋亡在这个过程中不起主要作用，但EVT诱导的VSMCs自血管壁迁移并消失在这个过程中起主要作用[12]。有研究证明EVT外泌体信号通过诱导VSMCs的迁移有助于螺旋动脉重铸。侵袭性强的EVT细胞模型产生的外泌体量多，而且诱导VSMCs迁移的能力强。用超声波破坏外泌体结构，该作用消失，说明结构完整才能保证外泌体的功能正常[13]。

HLA-G分子属于非经典的主要组织相容性复合物Ⅰ（MHCⅠ）类分子，特异性高表达于母胎界面的EVT。dNK细胞是妊娠子宫最主要的免疫细胞，占70%，能分泌多种细胞因子，其细胞毒性低于非妊娠期的子宫内膜NK细胞。HLA-G可与dNK表面的抑制性受体KIR结合，抑制其对EVT的杀伤活性，EVT如果减少或缺乏HLA-G表达将不可避免地被dNK杀伤，引起侵入过浅及螺旋动脉管腔狭窄，导致子痫前期的发生。有研究发现EVT来源的外泌体HLA-G阳性，具有抑制母体免疫细胞作用，而且用抗HLA-G的抗体可以检测出EVT来源的外泌体，为其分离纯化和功能研究提供基础[14-15]。

2.2.2 胎盘外泌体在母胎界面免疫耐受中的作用 在妊娠期，外泌体在胎盘与母体免疫系统间起作用，参与细胞间的信息传导。除了对dNK细胞的抑制外，胎盘外泌体还能抑制母体T细胞信号，提高母体对同种半异体胎儿的免疫耐受。这种母胎界面的免疫豁免归功于胎盘外泌体携带的细胞死亡因子配体（FasL）、程序性死亡配体 1（PD-L1）和 TNF 相关凋亡诱导配体（TRAIL），这些配体能够诱导母体T细胞的失活和死亡。而且胎盘外泌体还携带NK细胞表面活化性受体D（NKG2D）的配体、UL-16链接蛋白和MHCⅠ相关蛋白，能降低母体NK细胞活性，细胞毒作用减弱，有利于胎儿存活[16]。

2.2.3 胎盘外泌体参与胎盘屏障的形成 抗病毒机制对于妊娠是至关重要的，病毒感染会导致胎儿生长受限（FGR）、出生缺陷和（或）胎死宫内。母胎界面是非常关键的物理和免疫屏障，滋养细胞是母胎界面的主要组成成分，对防止病原体传播至胎儿微环境起重要作用[17]。有研究发现，人原代胎盘滋养细胞对多种病毒（如巨细胞病毒）有抗感染能力，而且滋养细胞的培养液能将抗病毒能力传递给非胎盘细胞（如内皮细胞），说明滋养细胞将某种抗病毒的物质分泌到培养液中，该物质就是外泌体，滋养细胞将特异性的miRNA包裹进外泌体，这种miRNA属于C19MC，具有抗病毒的能力[18]。

3 子宫螺旋动脉重铸不全相关妊娠并发症中胎盘外泌体的变化

不利于胎盘形成的因素增加妊娠并发症的发生风险，导致妊娠不良结局。特别是影响滋养细胞侵入和螺旋动脉重铸的因素损害胎盘功能及胎儿发育。螺旋动脉重铸不全会导致妊娠并发症，如子痫前期和FGR。

3.1 胎盘外泌体定量的变化子痫前期之所以在妊娠20周后发生血压升高等一系列临床表现，是因为子宫螺旋动脉的重铸是在妊娠20周左右完成的，在螺旋动脉重铸不全基础上胎盘缺血缺氧，滋养细胞、内皮细胞、血小板和白细胞等过量释放一系列炎性因子和促凝血因子，导致内皮损伤，血栓形成，全身过度炎性反应引起临床症状[19]。氧是调节EVT增殖和分化的主要因素，囊胚植入时子宫内的氧含量为3%，而蜕膜和子宫肌层的氧含量是8%～12%。氧含量的明显梯度是促进EVT重铸螺旋动脉的原因。而氧浓度异常会影响EVT的功能，EVT外泌体的释放及外泌体miRNA表达谱的变化，改变外泌体对内皮细胞的生物活性作用。缺氧可能是由滋养细胞分泌的缺氧诱导因子1α（HIF-1α）异常增多引起的[20]。Salomon等[21]采用纳米跟踪技术对正常妊娠和子痫前期患者的血浆总外泌体和胎盘外泌体进行定量分析，子痫前期患者的总外泌体和胎盘外泌体含量高于正常妊娠者，且在子痫前期症状出现前就开始升高，持续整个孕期。低氧诱导胎盘外泌体分泌增加，有研究对不同氧浓度下培养的EVT细胞模型（HTR-8/SVneo）分泌的外泌体进行纳米跟踪分析发现，1%氧浓度下该细胞分泌的外泌体量是8%氧浓度下的3倍，但是该细胞分泌的外泌体量（CD63+）占总外泌体的比例随着氧浓度的降低而降低，在8%氧浓度下该比例为（92±5）%，在 1%氧浓度下为（89±6）%，说明在缺氧条件下滋养细胞囊泡过量释放，胎盘氧化应激，循环中凋亡体、脱落体等其他囊泡的分泌量的增加多于外泌体量的增加[10]。

还有研究对早发型子痫前期与晚发型子痫前期患者血浆中的胎盘外泌体（PLAP+）与总外泌体（CD63+）进行定量分析，发现早发型子痫前期发病时胎盘外泌体分泌量较相同孕周正常妊娠者高25%～30%，总外泌体量高55%～60%。而晚发型子痫前期发病时胎盘外泌体分泌量较相同孕周正常妊娠者低50%，总外泌体量高45%。无论在早发型还是晚发型子痫前期，胎盘外泌体占总外泌体的比例都较正常妊娠降低[22]。

FGR的一个重要原因是胎盘灌注不足，子痫前期常合并FGR。有研究对FGR与小于胎龄儿（SGA）母血与胎儿脐血中的总外泌体和胎盘外泌体浓度进行定量分析发现，母血与脐血中的总外泌体在FGR组、SGA组高于正常组，胎盘外泌体在3组间的表达差异无统计学意义。但FGR组、SGA组胎盘外泌体占总外泌体的比例低于正常组。主要证明了以下几点：①胎盘来源的外泌体与总外泌体的比值是胎儿生长情况的重要标志（与胎儿体质量和胎盘质量呈正相关，有统计学意义），而且该比值可能影响母体的辅助性T细胞1型/2型（Th1/Th2）免疫状态，直接与母体炎性反应大小相关。②FGR组和SGA组该比值减小，而且病情越严重（超声指数异常和严重的FGR）该比值就越小。③母体与胎儿血循环中的该比值呈正相关，提示两循环中均有调节外泌体比例的机制[16]。

3.2 胎盘外泌体内容物的变化外泌体选择性的包裹信号分子，如蛋白质与miRNA，miRNA是小的非编码RNA片段，约22个核苷酸长度，通过与mRNA 3′末端连接调控基因表达。外泌体能将miRNA传递到靶细胞并影响靶细胞功能[23]。许多研究发现了子痫前期患者滋养细胞分泌的外泌体内蛋白质与miRNA出现异常。

在低氧条件下培养的EVT分泌的外泌体能增加血管内皮释放TNF-α，且外泌体本身也包含TNF-α，并将其转移到内皮细胞中，TNF-α是促凋亡因子，促炎症因子，导致母体过度炎性反应。胎盘蛋白13是滋养细胞分泌的蛋白，其生理功能是调节细胞与基质间的黏附，利于螺旋动脉重铸。近年研究发现胎盘蛋白13对妊娠相关疾病有预测作用。Sammar等[24]研究发现正常妊娠母体血清外泌体中胎盘蛋白13的含量一般会缓慢上升，子痫前期孕妇胎盘外泌体中胎盘蛋白13含量明显降低。

还有研究发现，低氧能影响EVT外泌体的miRNA表达谱。在不同氧浓度下，miRNA有独特的序列。与8%的氧浓度比较，在1%氧浓度下培养的EVT的外泌体miRNA有10种表达上调，分别是miR-339-5p、miR-16-5p、miR-10a-5p、miR-935、miR-197-3p、let-7a-5p、miR-324-5p、miR-15b-3p、miR-100-5p和miR-365-3p，且这些上调的miRNA大部分是肿瘤抑制因子，参与破坏细胞迁移与增殖。子痫前期患者的这些上调的miRNA可能抑制了内皮细胞的迁移和胎盘血管的形成。另有10种miRNA在低氧下表达下调，分别是miR-675-5p、miR-1246、miR-293-5p、miR-3178、miR-4792、miR-548o-3p、miR-1273g-3p、miR-762、miR-3182 和miR-523-3p。理论上这些下调的miRNA应该是促肿瘤形成因子，促进滋养细胞的侵袭和子宫螺旋动脉的重铸，如miR-1246和miR-762分别促进肺癌和乳腺癌细胞的增殖与浸润；但实际上这些miRNA中有的是肿瘤抑制因子，如肝细胞癌中的miR-3178和鼻咽癌中的miR-4792等。这个矛盾现象有待进一步研究[11]。

Ding等[25]研究发现，miR-519d能抑制EVT的迁移，且能使基质金属蛋白酶基因沉默，降低EVT的侵袭性。子痫前期患者的miR-519d表达上调[26]。Salomon等[20]总共确定了300种与妊娠有关的miRNA，其中hsa-miR-486-1-5p和hsa-miR-486-2-5p是子痫前期早期诊断的候选基因。Shen等[27]研究发现子痫前期患者胎盘外泌体miR-155升高，能够抑制人脐静脉内皮细胞释放具有舒张血管作用的内皮型一氧化氮合酶（eNOS），导致血管收缩，血压升高。

4 胎盘外泌体变化机制的探讨及展望

缺氧导致胎盘外泌体分泌增多，但是有的研究发现晚发型子痫前期胎盘外泌体血清含量低于正常妊娠，还有的研究发现正常、SGA、FGR组胎盘外泌体的血清含量差异无统计学意义，其原因可能是由于细胞缺氧的程度不同其凋亡的比例也不同[28]。由于EVT缺氧程度不同，螺旋动脉重铸不全的程度也不同，如果缺血缺氧的程度不足以导致滋养细胞释放的外泌体功能改变（如晚发型子痫前期），就会表现为胎盘外泌体含量的减少。如果缺血缺氧严重，导致外泌体内容物变化（miRNA及蛋白的改变）以致功能改变，就会表现为胎盘外泌体含量增加，促进妊娠并发症的发生。但在缺氧基础上，机体的其他细胞如内皮细胞、红细胞、白细胞、血小板等释放外泌体量会明显增加，所以在妊娠并发症胎盘外泌体占总外泌体的比例会下降，病变越严重下降就越多，该比例以及特异性的miRNA有望成为预测子痫前期和FGR的血清标志物。