肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体及其受体与宫颈癌的关系

张迪，李晓兰

肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）与其受体结合后选择性诱导肿瘤异常细胞凋亡，对正常细胞几乎无毒性作用，可增强放化疗对肿瘤细胞杀灭作用的敏感性，是极具潜力的抗肿瘤因子，受到广大学者的关注[1-2]。宫颈癌的治疗手段目前仍以手术切除、放化疗消灭肿瘤病灶为主，部分晚期宫颈癌因失去手术机会或因放化疗的并发症多、毒副反应强及耐药性高，导致治疗效果及生活质量无明显提高，5年生存率无有效延长。研究发现在宫颈癌组织中有TRAIL及其受体的表达，且与宫颈病变程度有关[3]。TRAIL及其受体的发现及其对肿瘤细胞的生物学作用可能为有效靶向治疗恶性肿瘤提供新方法。现就TRAIL及其受体与宫颈癌的关系进行综述，为后续宫颈癌的发病机制研究和诊治前景提供理论基础。

1 TRAIL及其受体

自1975年Carswell等[4]在研究经卡介苗致敏的小鼠注射大肠杆菌内毒素的过程中首次发现血清中的一种可以使移植肿瘤出血、坏死的物质——肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）以来，TNF-α、凋亡蛋白 1（Apo1 ligand，Apo-1L，即 Fas配体）等具有相同作用的类似因子相继被发现并形成TNF超家族 （tumor necrosis factor super family，TNF-SF）。1995 年，Wiley等[5]从人心肌互补 DNA（complementary DNA，cDNA）文库（cDNA Library）中首次克隆出第 3个TNF-SF的凋亡分子，其能诱导Jurkat细胞和EB病毒（epstein-barr virus）转化的人类B淋巴细胞凋亡，命名为TRAIL，因与Apo-1L具有较高同源性，又称为凋亡素2配体（Apo2 ligand，Apo-2L）。

人类的TRAIL基因，cDNA全长1.05 kb，位于3号染色体的3q26.1～26.2[6]。TRAIL基因编码的TRAIL蛋白含有281个氨基酸，属Ⅰ型跨膜糖蛋白。TRAIL氨基（N）端位于胞浆内，由15～40个氨基酸形成疏水区并形成跨膜结构，胞内区很短没有明显的信号肽，可溶型分子N端氨基酸的缺失不影响TRAIL的生物活性。TRAIL羧基（C）端位于胞外，较长，被半胱氨酸蛋白水解酶水解后形成具有生物活性的可溶型TRAIL（sTRAIL），参与形成β-链夹心状同源三聚体，与受体结合诱发细胞凋亡作用。其中，TRAIL蛋白的95～281位残基之间有且只有1个不配对的半胱氨酸（C230）可螯合锌原子共同形成同源三聚体后结合受体，是TRAIL不同于其他TNF配体的特殊结构。C230是TRAIL发挥作用的重要功能基团，当其结构发生变化或编码C230基因异常时，无法形成三聚体，TRAIL与受体的结合能力降低，诱导细胞凋亡的能力明显下降甚至消失[7]。

人类的TRAIL基因的转录活动存在于多种正常组织器官，如胎肝、胎肺、胎肾以及成人脾、胸腺、前列腺、子宫、卵巢、小肠、结肠、外周血、淋巴细胞、心脏、胎盘、骨骼肌、肾脏等，但脑、肝、睾丸中不转录此因子[5]。TRAIL对大多数肿瘤细胞有抑制生长、诱导凋亡的抗肿瘤活性。

1997年始，5种TRAIL受体相继被发现，因其结构、功能的不同主要分为3类：①TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5：因含有与TRAIL结合后诱导细胞凋亡的完整死亡结构域（death domain，DD）被称为死亡受体（death receptor，DR）。两者均为Ⅰ型跨膜蛋白，胞膜外区含有丰富的半胱氨酸和与配体结合的支撑结构，与配体结合后DD招募Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associating death domain，FADD）与caspase-8酶原，一种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），联合形成死亡诱导复合物（death inducing signaling complex，DISC）引起体内caspase-8/caspase-3/caspase-10等酶原激活并经线粒体途径产生阶梯式caspase蛋白酶级联反应诱导细胞凋亡。同时，具有活性的caspase-8催化线粒体表面的Bid蛋白断裂形成有活性的tBid蛋白（truncated Bid），引起线粒体发生电生理改变，促使细胞色素C（cyt C）从线粒体中外溢，在三磷酸脱氧腺苷条件下与凋亡酶激活因子 1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）结合形成多聚体再与caspase-9结合形成凋亡体，激活自身的caspase-9，被激活的caspase-9激活其他caspase，以增强阶梯式caspase蛋白酶的级联反应和诱导细胞凋亡的能力；②诱骗受体（DcR1、DcR2）：DcR1没有DD，DcR2含1/3的DD，两者不能转导和（或）不能转导有效的死亡信号，细胞凋亡逃逸，被称为诱骗受体（decoy receptor，DcR）；③可溶性骨保护素（osteoprotegerin，OPG）：一种分泌型糖蛋白，其配体是破骨细胞分化因子，与核因子κB（NF-kB）激活剂的受体结合，以减少破骨细胞数量、增加骨密度、促进骨质沉积等多种方式调节并维持骨骼系统中成骨和破骨的动态平衡[8-12]。OPG在某些肿瘤中一定程度上可竞争性抑制TRAIL与死亡受体结合，发挥抑制TRAIL诱导的细胞凋亡的作用，但此作用微弱。

2 TRAIL及其受体在宫颈癌上皮细胞中的表达

TRAIL系统主要通过激活外源性特异受体凋亡途径参与体内免疫调节、免疫自稳和免疫监视，在肿瘤发生、转移及自身免疫性疾病等病理生理过程中发挥重要作用[13]。目前，TRAIL及其受体在恶性肿瘤中的作用机制复杂且尚无定论。有研究表明，在宫颈癌中存在TRAIL及其受体的表达失衡，或因TRAIL异常表达或因各受体表达异常变化，凋亡系统失调，导致细胞异常增殖肿瘤发生[3，14]。有研究认为，宫颈癌的发生与TRAIL的减少关系密切，TRAIL减少，与DR结合率明显降低，诱导肿瘤细胞凋亡作用弱，肿瘤异常增殖[14]。张文凤等[15]研究发现TRAIL及DcR1受体在宫颈癌组织中显著低表达于正常宫颈组织，而DR4在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，可能在宫颈癌的发生过程中存在着TRAIL、DcR1的丢失和DR4的反应性增多，造成TRAIL与其DR结合所诱导的凋亡减少，促进了宫颈癌的发生、发展，提示当TRAIL不足时，即使DR表达增多，两者结合诱导细胞凋亡作用将显著降低。郭双毅等[16]利用稳定、无毒性、敏感性高的真核细胞表达载体pEGFP转染TRAIL质粒方法研究表达pEGFP-TRAIL的HeLa细胞的凋亡率时发现，外源性TRAIL基因可诱导HeLa细胞凋亡。然而，另有研究认为，在宫颈癌中TRAIL的表达无明显变化，TRAIL受体表达变化异常显著。如张菊青等[17]在宫颈各级别病变的研究中发现，TRAIL的表达随着宫颈病变程度的加重稍减少或无显著差异，而DR4在宫颈癌中的表达量明显下降。李晓兰等[3]研究发现TRAIL在宫颈炎症、早期癌变及复发的宫颈病变组织细胞中的表达无显著性变化，DR4、DR5在早期宫颈癌中表达明显减少，TRAIL与DR结合减少，而DcR1、DcR2无显著变化，引起宫颈癌细胞的凋亡逃逸；在复发的宫颈癌中，TRAIL的表达无显著差异，但死亡受体和诱骗受体表达均明显增加，OPG的表达显著减少，TRAIL及其受体表达显著失衡。因此，宫颈癌中TRAIL及其受体的表达变化仍需大量实验研究，上述研究结果虽然不尽相同，但提示了当宫颈细胞中TRAIL配体与受体系统表达平衡失调到一定程度时，细胞程序性死亡将发生异常变化，最终导致宫颈病变发生。

Horak等[18]认为大部分肿瘤细胞同时表达DR4和DR5，但是往往只有一种受体起主要作用，部分肿瘤细胞只单一地通过DR5或DR4来传导TRAIL的杀伤信号。Kendrick等[19]在研究宫颈癌细胞DR4、DR5表达水平、重组TRAIL和凋亡受体抗体时发现，即使凋亡受体高水平表达，也并非所有宫颈癌细胞群都可以诱导产生凋亡反应。因此，即使肿瘤细胞表面检测到DR4和DR5的表达，其中一个受体也可能呈无功能状态不能发挥诱导细胞凋亡的效应。但也有学者提出完全不同的观点，认为肿瘤细胞逃避凋亡路径的活化才是产生肿瘤发生的基本原因，而凋亡受体的表达水平可能与凋亡的产生相关性不大，细胞内凋亡调节机制对诱导宫颈肿瘤细胞凋亡亦有一定影响。例如Cheung等[20]研究发现宫颈癌细胞中的Bax（Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bcl-2-associated X）、caspase-3和 caspase-6等蛋白的表达均显著低于宫颈癌前病变，提示肿瘤凋亡机制可能存在缺陷。Sultana等[21]研究宫颈癌化疗前后p53表达情况发现，化疗有效与无效的宫颈癌细胞中p53表达无明显区别，但有效的宫颈癌标本中Bax的表达与无效的宫颈癌相比明显增加，提示TRAIL受体活化因子可促进凋亡受体的表达而加强细胞毒性作用。

虽然，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染是导致宫颈癌的明确病因，但在机体内宫颈由正常组织发展成癌的机制是非常复杂的，受体内外多重因素的影响，其中TRAIL及其受体系统的表达变化、肿瘤凋亡机制缺陷、免疫微环境的改变等均受众多因子的严密调控及影响，因此TRAIL及其受体系统在宫颈癌中的具体作用机制有待进一步研究。

3 TRAIL及其受体的临床研究进展

TRAIL具有特异性杀伤肿瘤细胞的特性，临床前研究中表现出了优异的抗肿瘤效果及良好的安全性。2004年，重组人TRAIL（recombinanthumanTRAIL，rhTRAIL）被美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床试验研究。Ⅰ期临床试验研究结果显示，rhTRAIL联合用药比单一用药抗肿瘤疗效更佳，体现在：①rhTRAIL对人体没有明显的毒性反应，具有良好安全性；②rhTRAIL单一给药或与其他化疗药物联合用药均取得阳性抗肿瘤效果；③rhTRAIL联合用药可能上调DR4、DR5的表达水平，放大了TRAIL诱导凋亡效应，调节了TRAIL凋亡通路或通过调节其他与诱导凋亡有关的信号因子提高了肿瘤细胞对TRAIL的敏感性[22]。紫杉醇（Paclitaxel）、吉西他滨（Gemcitabine）等多种化疗药物均可以增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性[23-24]。此外，放射治疗也可增加肿瘤对TRAIL和DR4/DR5抗体的敏感性[25]。Pavet等[26]利用小分子无机物连接短肽片段提纯模拟TRAIL中与受体结合的区域，可以与TRAIL受体高效结合，并诱导肿瘤细胞凋亡，有显著的抗肿瘤活性，提示TRAIL发挥作用的有效片段可代替TRAIL。在研究实践中，由美国Amgen（安进）公司研发的rhTRAIL，又称为APO2L.0（dulanermin/AMG-951），因其质量小、半衰期短、易被机体清除，其血药浓度下降，最终凋亡信号减弱甚至中断而无法产生良好的抗肿瘤效果，利用聚乙二醇与TRAIL蛋白分子相耦联形成聚乙二醇化的TRAIL （PEG-TRAIL Mcropheres，PLGA），可延长TRAIL在体内的半衰期，但其空间结构发生了变化而不可避免地降低了其效应作用[27-29]。Guo等[30]和van der Sloot等[31]利用计算机分子模拟技术对TRAIL进行优化，设计出可特异性结合DR5或者DR4的TRAIL变体，其特异性和活性都相对较高，可避免与正常细胞表面DcR1/DcR2的非特异性结合，从而表现出更强的抗肿瘤活性。目前TRAIL已顺利进行Ⅱ期临床研究阶段。但是TRAIL蛋白作为抗肿瘤药物的临床研究结果不如预期，尚未取得满意疗效[32]。

TRAIL受体激动剂、TRAIL受体活化因子、DR抗体拮抗剂等通过增强TRAIL受体特异性、增加受体表达量或游离量来增强TRAIL敏感性，加强细胞毒性作用。Lim等[33]和Horinaka等[34]研究发现，TRAIL中加入类黄酮可在一定程度上抑制宫颈癌传代细胞产生的TRAIL耐受性。DR抗体拮抗剂通过结合受体抗体，相对增加DR4和DR5受体游离数目，提高TRAIL与DR结合概率，提高细胞凋亡率。Straughn等[35]在研究靶向作用于DR4和DR5受体的单克隆抗体拮抗剂的过程中研究了DR4和DR5受体的单克隆抗体，在抗-DR5单克隆抗体（TRA-8）联合治疗宫颈癌的模型中发现，TRA-8联合放化疗同样产生协同作用。研究发现在部分肿瘤中，如乳腺癌等，TRAIL与特殊受体的抗体结合后靶向高表达或通过特异病毒载体将TRAIL基因转运到肿瘤部位局部表达TRAIL蛋白，发挥抗肿瘤作用[36]。遗憾的是，目前在宫颈癌的相关研究中尚未发现可直接或间接促进TRAIL系统在局部微环境高表达，可提高TRAIL特异性及抗性的特殊结构。

4 结语

综上所述，TRAIL及其受体特异性结合后，对肿瘤细胞有特异性杀伤作用而对正常细胞无毒性的高特异性、高靶向性、少毒副作用等特点已引起了学者们的广泛关注，使其具有广阔的应用前景。通过了解TRAIL及其受体在宫颈癌中的作用可为宫颈癌的发生机制以及宫颈癌的靶向诊治的新方法提供一定的理论基础。但在TRAIL应用于临床前必须证实其安全及有效性。目前，由于TRAIL系统在宫颈癌中的研究局限，宫颈癌相关研究尚处于临床试验阶段。随着TRAIL相关研究的逐渐增多，其诱导肿瘤细胞凋亡的机制及调控机制将逐渐明确，其发挥作用的所需条件亦将日渐明朗，临床治疗中的应用价值亦会逐步升高。TRAIL及其受体系统将为恶性肿瘤患者包括宫颈癌患者诊治提供一条新途径，为靶向治疗提供新靶点。