胆管细胞向肝细胞分化：再生医学的机遇

金银鹏

肝脏在出现急性细胞毒性损伤或外科手术切除后会发挥强大的再生能力，以代偿受损肝实质功能。肝细胞或胆管细胞损伤后，肝实质通常由现有已分化的肝实质细胞和胆管上皮细胞(BECs)增殖和补充来修复。然而对于慢性肝细胞损伤，已分化肝细胞的细胞修复能力不足，肝细胞进入复制性衰老阶段，增殖能力丧失，无法再生成肝实质细胞。此时，慢性肝损伤患者表现出胆管反应，BEC复制水平增加，与疾病晚期病理表现一致。基于此，终末小胆管会产生多潜能性BEC，有助于肝实质的修复。最近研究证明，BEC能够在肝细胞增殖受阻时转化为肝细胞。实际上，肝损伤人群和动物模型均表现出胆管细胞向肝细胞转化，其特征为肝细胞生长或增殖减少和衰老[1]。

不同的动物实验模型被用来研究反应性BEC的激活和增殖，包括胆碱不足的蛋氨酸补充(CDE)、3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可利定(DDC)、蛋氨酸和胆碱不足(MCD)以及硫代乙酰胺(TAA)饮食。CDE饮食喂养小鼠谱系追踪研究首次证实，BEC并非新生肝细胞主要来源，也并非促使肝实质恢复的重要因素。在肝细胞损伤和衰老或抑制肝细胞增殖的转基因小鼠模型研究中，已证实反应性BEC在肝受损再生时发挥干细胞作用，并能显著促进肝细胞更替。这一现象在不同的饮食模式中重复出现，包括CDE、DDC、MCD和TAA。值得注意的是，为模拟人类慢性肝损伤环境，研究人员最近基于经长期TTA或DDC治疗且无任何基因疗法介入的严重肝损伤小鼠中开展了一项研究，该研究进一步支持BEC可转化为肝细胞的结论。这些结果令人振奋，但仍需加以拓展验证，并提供相应信息，如再生过程的背景、所涉及的分子机制和治疗机会等。

Russell等研究了BEC转化为肝细胞的差异性，对CDE饮食诱导损伤后条件性敲除β-连环蛋白的小鼠模型进行复杂的谱系追踪研究，旨在研究存在慢性肝损伤时肝细胞的增殖障碍以及BEC对肝实质的潜在修复作用[2]。Wnt/β蛋白信号通路可影响肝脏发育及其健康、疾病和再生。与其他通路相比，该分子通路能促进肝细胞增殖，但其缺陷在于延缓肝细胞再生。为研究β-连环蛋白在肝脏的特异性丢失是否阻碍CDE饮食诱导肝损伤的肝细胞增殖从而引发导管反应，研究人员采用肝细胞和BEC中均无β-连环蛋白表达的敲除(KO)白蛋白Cre Ctnnb1小鼠。值得注意的是，尽管这些细胞中β-连环蛋白丢失，慢性(2周)饲养CDE饮食、被敲除白蛋白Cre Ctnnb1的小鼠仍表现出严重肝损伤、肝细胞增殖受阻和BEC扩增。这些数据证实β-连环蛋白在肝损伤后可调节肝细胞的再生能力，也存在β-连环蛋白相关的独立胆管反应。此外，在甲状腺结合球蛋白启动子(AAV8-TBG-CRE)的作用下，向这些小鼠注射编码CRE重组酶的腺相关病毒，将敲除了β-连环蛋白的肝细胞永久性标记为EYFP，从而产生肝细胞特异性β-连环蛋白敲除小鼠模型(Ctnnb1flox/flox、Rosa-stopflox/flox- EYFP、TBG-Cre)。用CDE饮食喂养这些小鼠2周后，小鼠出现严重肝损伤，但几乎未发生肝细胞增殖，也未发现BEC来源的肝细胞。当予以2周的CDE饮食后再给予2周正常饮食，几乎20%的HNF4α阳性肝细胞呈β-连环蛋白阳性和EYFP阴性，表明经过恢复期后反应性BEC可转化为肝细胞。这些BEC来源的肝细胞大多不表达胆管细胞标记物，聚集在BEC附近的门静脉周围区域，表现为增殖增加，表明它们在重建损伤肝实质中可发挥潜在作用。特别是在恢复正常饮食后仅3 d即观察到β-连环蛋白阳性/HNF4α阳性/CK19阳性的肝细胞样细胞(具有肝细胞形态)，表明BEC分化是一个随时间推移而发生的动态过程。值得注意的是，Russel等证实在长期的恢复过程研究中，BEC向肝细胞的转化是永久性的，其中约70%被定义为HNF4α阳性细胞的肝细胞，在3个月的恢复期后呈EYFP阴性，且数量在6个月后仍保持不变。为支持这些发现，研究人员使用Krt19- CreERT；Rosa-stopflox/flox；tdTomato标记BEC，同时用 GalXC-Ctnnb1(一种与肝细胞靶向配体N-乙酰半乳糖胺偶联的Ctnnb1 RNAi)敲除肝细胞中的Ctnnb1进行谱系追踪研究诱导特异性敲低β-连环蛋白的肝细胞。与之前观察结果一致，肝细胞中CTnnb1的敲除抑制了其增殖能力并导致严重的肝损伤，促进了在恢复期BEC来源的肝细胞产生，有助于修复损失的肝实质。

这些结果有助于扩展人们对BEC可塑性的认知，并证明BEC可在肝损伤和肝细胞增殖受阻后增殖及分化为肝细胞，并具有长期的肝再生能力。该研究在机制层面证实了β-连环蛋白在调节肝细胞再生能力中的作用，并确定了β-连环蛋白非依赖性BEC扩增。由于在Ctnnb1flox/flox、Rosa-stopflox/flox- EYFP、TBG-Cre标记的小鼠肝脏中观察到了活性β-连环蛋白信号，表明β-连环蛋白可能在BEC向肝细胞分化中起到潜在的作用。尽管如此，在该模型中尚无法排除其他非实质细胞中也存在活性β-连环蛋白表达，这需要进一步阐明。

实际上，当前研究的分化过程仅在去除损伤因子后及经历恢复期后所得到的观察结果才有意义。这种细胞事件可参与肝损伤缓解或消除损伤因子的慢性肝病患者的肝脏再生，此类患者包括接受抗病毒治疗后的慢性丙型肝炎(HCV)、改变生活方式后的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或戒酒后的酒精性脂肪性肝炎(ASH)。

Russell等进行的研究较好地证明了反应性BEC可转化为肝细胞，至少在慢性肝病这种特定的实验条件下，BEC可促进肝组织再生。由于目前肝移植是治疗晚期慢性肝病的唯一方法，该研究为未来基于再生医学的治疗干预开辟了新的道路。阐明BEC转化为肝细胞的分子机制将为再生医学治疗慢性肝病提供新的治疗机会[3]。然而，引发这种分化和随后的大量修复的肝损伤阈值，以及这些细胞的功能性及其在肝脏中的长期作用仍有待确定。