评估上市前药物发生DILI的风险

杨长青

一、 用反应代谢物从化学结构上预测具有肝毒性的药物

反应代谢物(reactive metabolites，RM)的概念首先来自于威斯康星大学医学院米勒课题组的研究。他们首先证明了苯胺类偶氮染料的肝毒性和致癌性是由其氧化代谢后形成的RM所引起的。在将这一概念扩展到人类DILI的研究中，首先发现了细胞色素P450 (CYP)介导的抗炎药对乙酰氨基酚的RM是反应性醌-亚胺中间体，该中间体能够耗尽机体内源性抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)，并与肝蛋白共价结合。基于这些以及过去3～4年间的许多其他毒性物质的结构学研究，现在普遍认为，RM才是造成某些特异质型DILI的病因。通过与细胞表面蛋白共价结合形成半抗原，RM可导致细胞的功能障碍或后继免疫反应。在众多RM形成实验中，已推导出这些特定的分子结构，因而将这类特定分子结构在已公示的信息中限定为“警示结构”。例如，最近对68种被召回或与DILI黑框警告(BBW)相关的药物进行分析表明，其中55种(81%)药物具有警示结构，而这55种药物中确有36种(65%)存在RM形成的证据。因此从结构-活性关系研究中也可以看出，RM形成是特异质型DILI的一个令人信服的论据，而RM缺失与后继药物的安全性显著改善又是一致的。该报告将突出RM概念和结构警报的证据，建议利用结构-毒性关系作为评估上市前药物发生DILI风险的独立预测因子。

二、 应用微工程化人肝细胞共培养模型预测药物DILI风险

芝加哥伊利诺斯大学的Khetani教授认为，动物模型中的DILI并不总是与人类DILI相关，部分原因是药物代谢途径的物种差异。因此人类肝脏的体外模型现在正越来越多地应用于补充、甚至在某些情况下取代动物试验；更重要的是，这样的模型能够在整个化合物开发过程中更快、更经济地测试药物和工业化学品的肝毒性。用原代人肝细胞模型评价化合物是筛选DILI风险的理想标准。然而在传统的二维单细胞培养模式中，这类细胞还是表现出表型功能的快速下降。他们在过去的10～15年中，运用半导体驱动的微加工工具，以及肝细胞与肝脏或非肝脏来源的非实质细胞的共培养技术，精确调节肝细胞周围的二维和三维微环境，以增强和稳定细胞表型功能。将肝脏来源的非实质细胞(例如库普弗细胞、肝星状细胞和窦状内皮细胞)置于工程化肝细胞培养平台中，可确定细胞-细胞间的相互作用在人类DILI进展中的作用途径。利用患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的人肝细胞和适应性免疫攻击来阐明特异性DILI的发生机制，也是未来努力的方向。总之，微工程化人肝细胞共培养模型具有预测上市前药物发生DILI风险的巨大潜力，并有助于阐明DILI的潜在机制。

三、 评估药物研发中DILI风险的新策略

临床前的动物模型对检测大多数人类的DILI普遍不敏感。因此，在药物研发过程中需要对其DILI风险进行广泛的评估。来自旧金山Genentech公司的Proctor博士采用了一组体外模型，并特别考虑了理化特性、警示结构和预测剂量/暴露，以研究潜在的DILI风险。当然，在缺乏临床前体内肝毒性信息的情况下，很难利用体外数据来决定化合物的取舍。造成这一挑战的因素之一是不确定哪些参数能够真正预测DILI。这在一定程度上也是由于该领域的文献中有许多相互矛盾的报道，这些报道使用了不同的测试系统、分类标准、统计方法和实验条件，使得交叉研究比较困难。为了解决这个问题，他们开始评估药物大量的生理化学特性，通过计算机模拟酶学和体外测定的整体预测性，使用一致的验证系统，运用统计学方法单独或组合地识别预测各参数的性能。在使用不同的测试系统对173种上市前化合物进行分析后，发现与临床DILI相关的占47%。对于以IC50值为终点的参数，他们还通过校正每个化合物有效暴露时的最大血浆浓度来估计体外安全边际(MOS)。

四、 计算机模拟和体外实验模拟，预测特异质型DILI

在肝脏的适应或“耐受”压力方面，人与人之间存在着差异性，这也是特异质型DILI发生的因素之一。来自哈姆纳药物安全研究所Howell博士重点讨论了这一因素。肝细胞应激反应的改变影响着胞内线粒体的生物形成能力，描述这一动态过程的数学模型已被纳入到DILI评估系统：DILIsym。DILIsym是一项在历时9年努力后，得到了19家最大的制药公司、FDA和学术界共同支持所产生的一个DILI评估系统。它采用了“中间”定量系统毒理学(QST)的方法，并运用微分方程来概括药物可能导致肝损伤的关键过程，通过改变参数来创建模拟的患者群体(SimPops)，以反映遗传和非遗传性变异。该评估系统已经完成了软件制作(DILIsym，DILIsym Services Inc.，Simulations Plus公司)，将会越来越多地应用于制药公司的开发决策。DILIsym已经在多组上市前的药物中进行了测试，其在80%以上的预测病例中都是准确的。