野生和室内饲养高原鼠兔肠道菌群多样性的比较

谭春桃，李 欢，曲家鹏

（1. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 兰州大学公共卫生学院，甘肃 兰州 730000；4. 青海省动物生态基因组学重点实验室，青海 西宁 810008）

肠道微生物在宿主的消化吸收、能量代谢、免疫调节以及生理健康等方面均有重要的作用[1-4]，且易受食物的影响[5-8]。肠道微生物通过提高宿主对高纤维、低蛋白植物的消化吸收能力，增强食物利用率和对极端环境的耐受性，维持食物匮乏时动物的正常生理活动[9-11]。肠道微生物还可以激发动物的细胞与体液免疫，增强动物的免疫力，降低疾病发生概率，维持宿主的生理健康[12-15]。某些植物对食草动物的取食具有一定的防御作用，会形成次生化合物，而动物的肠道微生物有助于动物降解次生化合物，获取食物资源，提高动物的存活率[16-17]。尽管有关肠道微生物在人、模式动物和低海拔地区分布动物的研究较多[18-20]，但有关高海拔地区动物肠道微生物的研究甚少。高海拔地区分布的动物面临低温、低氧的极端环境，其肠道微生物可能具有更加复杂的多样性和功能[21-22]。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae)是小型植食性哺乳动物，广泛分布于青藏高原海拔 3 200～5 300 m的高海拔地区[23]。夏季野生高原鼠兔的食物来源丰富，以摄食垂穗披碱草(Elymus nutans)、黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala)和早熟禾(Poa annua)等植物为主[24-25]。而室内饲养高原鼠兔的食物主要由粗蛋白、粗纤维、粗脂肪等组成，具高能量、高蛋白、低纤维等特点。除此之外，高原鼠兔是青藏高原的特有种和关键种，维持着青藏高原生态系统的稳定性[26-27]。

随着第二代高通量测序技术的发展，已有研究表明食物成分对高原鼠兔肠道微生物的组成和多样性有显著影响，个体的食物成分越相似，其肠道微生物组成与多样性越相似[28]。高原鼠兔肠道微生物的组成和多样性与种群密度有关，种群密度越高，个体间肠道微生物的相似度越高[29]。高原鼠兔的肠道微生物与环境微生物组成差异显著，表明肠道微生物受环境影响小，且具有宿主选择专一性[30]。尽管有关高原鼠兔肠道微生物的研究已有一系列的进展，然而对于夏季野生和室内饲养高原鼠兔肠道微生物的差异尚不清楚。

为了更好地控制试验变量，往往需要将野生动物带回实验室进行比较[31]，已有研究表明野生和室内饲养状态下动物的肠道菌群有显著差异[32-33]。本研究基于16S rRNA基因高通量测序技术，研究夏季野生和室内饲养高原鼠兔肠道微生物的差异，探讨室内饲养条件下高原鼠兔是否会保留野生鼠兔的肠道菌群，以及保留了多少比例的菌群，为以后是否能在室内饲养条件下研究野生小哺乳动物的肠道菌群提供依据。

1 材料和方法

1.1 样品收集

2014年6月，在青海省果洛藏族自治州玛沁县 (100°21′ E，34°24′ N，3 846 m)采用绳套法捕捉6只健康成年高原鼠兔带回实验室。将鼠兔置于鼠笼 (聚丙烯材质，310 mm× 230 mm× 160 mm)中单笼饲养，提供足够的兔颗粒维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)和纯净水。8月10-12日08:00-10:00，使用75%乙醇擦拭灭菌过的眼科镊收集新鲜粪便样品置入无菌管中，快速转移到-80 ℃超低温冰箱内保存。8月14-16日08:00-10:00，在玛沁县相同的野外样地，使用绳套法捕捉高原鼠兔，置于75%乙醇消毒后的鼠笼中，使用灭菌后的眼科镊收集新鲜粪便样品置入无菌管中，并迅速置于液氮罐中，随后转移到-80 ℃超低温冰箱内保存。本研究共收集了室内鼠兔粪便样本6份(雌性4份，雄性2份)，野外鼠兔粪便样本6份(雌性1份，雄性5份)。

1.2 食物组成

2014年8月16日14:00-18:00在样地随机选择 10 个 25 cm × 25 cm 的样方，刈割植物的地上部分并区分高原鼠兔喜食的物种，混匀后称量植物鲜重，然后带回实验室在75 ℃的恒温箱中烘干至恒重并称量计算植物中的水分含量，然后测定干物质的营养成分，无氮浸出物成分复杂，主要成分有淀粉、单糖、有机酸和糊精等。无氮浸出物的含量等于干物质含量减去粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分的含量。野外高原鼠兔喜食植物及营养成分和室内饲料原料及营养成分如表1所列。

表1 野生和室内饲养高原鼠兔食物原料及营养成分Table 1 Food material and nutrition contents of wild and laboratory-reared plateau pikas

1.3 16S rRNA 测序和生物信息学分析

采用生工Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒提取肠道内容物的总DNA。用可见分光光度计对DNA 进行集中纯化。提取的 DNA 用 10 ng·μL-1的稀释液用来做PCR扩增。用通用引物515F(5-GTGY CAGCMGCCGCGGTA-3)，909R(5-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3)和 12 nt独特的条形码在 515F的5′末端扩增微生物的 16S rRNA 的 V4-V5 区域[34]。PCR 扩增用含有 1 × PCR 缓冲液的 25 μL 反应混合物、1.5 mmol·L-1MgCl2和 0.2 mmol·L-1的脱氧核苷三磷酸加 1.0 μmol·L-1的引物和 0.25 U 的 Ex Taq，最后加入10 ng基因组DNA。为了减少PCR偏倚，每个样品做2个PCR平行。在PCR仪上于94～96 ℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。先于94 ℃中保持3 min使模板变性，然后依次保持 94 ℃ 的 40 s、56 ℃ 的 60 s、72 ℃ 的 60 s，如此做 30 个循环，最后在 72 ℃ 中保留10 min使产物延伸完整。最后将纯化的PCR产物汇集在相同浓度使用Illumina Miseq测序仪进行测序[35]。

原始序列数据使用QIIME1.7.0处理(http://qiime.org/tutorials/tutorial.html)。所有序列都被修剪并根据条形码分离每个样本(条形码错误碱基 = 0)。使用Flash-1.2.8软件根据双末端序列重叠的区域进行拼接[36]。获得的双末端序列进行过滤(保留那些读取长度 ＞ 300 bp，无模糊序列 N，平均序列质量分数 ＞ 30的序列)作进一步分析。由于在PCR扩增叶绿体序列可能污染，采用Metaxa2软件工具从大量的测序数据删除叶绿体序列[37]。对齐的16S rRNA基因序列被用于使用Uchime算法进行嵌合体检查[38]。所有的序列使用CD-HIT以97%的相似度聚类为操作分类单元(OTU)，过滤只有1条序列的OTU[39]。为了比较不同测序深度的样本，每个样本的序列统一为5 070个序列。计算α多样性指数，包括PD_whole_tree，Chao1，Shannon，Observed-species，Goodscoverage，Simpson，Equitability等多样性指数，通过 QIIME处理计算 weighted UniFrac和 unweighted UniFrac 距离矩阵[40]。

原始序列数据可在欧洲核苷酸数据库中获得，数据编号及网址为PRJEB26642 (http://www.ebi.ac.uk/ena/datd/view/PRJEB26642)。

1.4 统计分析

前期研究已表明，性别对高原鼠兔肠道微生物无显著影响[28-29]，故本研究没有分析性别对高原鼠兔肠道微生物的影响。采用单因素方差分析，比较室内与野生高原鼠兔肠道微生物的α多样性与组成的差异。基于OTUs使用Venny 2.1.0做维恩图，分析两组鼠兔肠道微生物的差异大小。使用vegan package对 weighted UniFrac和 unweighted UniFra距离矩阵分别进行PCoA分析来比较两组鼠兔肠道微生物群落结构(β多样性)的差异。除维恩图外，其余统计分析均在R 3.2.5上实现。

2 结果

2.1 肠道微生物组成

在门的水平上，野生高原鼠兔肠道微生物主要由拟杆菌门 (Bacteroidetes)(43.06% ± 5.52%)、变形菌门 (Proteobacteria)(24.84% ± 5.70%)、厚壁菌门 (Firmic utes)(11.21% ± 4.07%)、 放 线 菌 门 (Actinobacteria)(8.62% ± 3.14%)、 蓝 细 菌 (Cyanobacteria)(0.98% ±0.11%)和 螺 旋 体 门 (Spirochaetes)(0.75% ± 0.31%)、疣 微 菌 门 (Verrucomicrobia)(0.31% ± 0.20%)等 组成；室内饲养高原鼠兔肠道微生物主要由拟杆菌门 (61.61% ± 5.57%)、 厚 壁 菌 门 (21.82% ± 3.15%)、变形菌门 (4.32% ± 1.31%)、疣微菌门(2.41% ± 1.38%)、螺旋体门 (2.11% ± 0.50%)、蓝细菌 (1.23% ± 0.16%)和放线菌门 (0.68% ± 0.07%)等组成 (图 1)。

在门的水平上，室内鼠兔肠道微生物中拟杆菌门和螺旋体菌门的相对丰度显著高于野生鼠兔，而变形菌门和放线菌门的相对丰度显著低于野生鼠兔(表2)。在属的水平上，室内饲养高原鼠兔肠道微生物中S24-7中某属、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌科下某属、梭菌属(Clostridium)、梭菌目下某属、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、瘤胃菌科下某属、肉杆菌属(Carnobacterium)的丰度均显著高于野生鼠兔，而黄杆菌属(Flavobacterium)、丛毛单胞菌科下某属(Comamonadaceae.Other)、节杆菌属(Arthrobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、毛螺旋菌科下某属(Lachnospiraceae.Other)的丰度均显著低于野生鼠兔(P＜0.05)(表 2)。基于 OTUs表的维恩图分析，结果表明野生和室内饲养鼠兔的OTUs有50.1%重叠，而49.9%的OTUs是各自特有的(图2)。

图1 野生和室内饲养高原鼠兔肠道菌群在门水平上的组成成分(仅显示相对含量 ＞ 1%的菌群)Figure 1 Composition of bacterial communities at phylum level in the gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas (Only those phyla with mean relative abundance ＞ 1% were shown)

2.2 肠道微生物的多样性

野外和室内饲养高原鼠兔肠道微生物的α多样性指数均无显著差异 (P ＞ 0.05)(表 3)。为了评估β多样性，分别计算了weighted UniFrac距离矩阵和unweighted UniFrac距离矩阵，前者能更清楚地展示野生和室内饲养鼠兔肠道微生物的差异，使用weighted UniFrac距离矩阵做PCoA主坐标分析能将野生和室内饲养的高原鼠兔肠道微生物明显分开(图3)，其β多样性具有显著差异。

3 讨论与结论

夏季野生和室内饲养的高原鼠兔肠道微生物在组成成分上有显著差异。在门的水平上，野生高原鼠兔肠道微生物主要由拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门组成，而室内饲养鼠兔肠道微生物主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成。室内饲养鼠兔肠道微生物中拟杆菌门和螺旋体菌门显著高于野生鼠兔，其中拟杆菌门中的S24-7的丰度高于野生鼠兔。S24-7易受环境和食物的影响，Ormerod等[41]发现S24-7中有多种细菌会使降解碳水化合物的酶丰度增加，本研究中室内饲养食物无氮浸出物的含量显著高于野生食物，S24-7能提高动物肠道对无氮浸出物中淀粉等碳水化合物的利用，这可能是导致室内饲养鼠兔肠道中S24-7的丰度显著高于野生个体的主要原因。放线菌门中大多数细菌可以降解纤维素[42]，野生高原鼠兔肠道微生物中放线菌门丰度显著高于室内鼠兔，可能与野外食物资源中纤维成分高于室内饲料有关。野生鼠兔肠道菌群中黄杆菌属、金黄杆菌属、假单胞菌属、从毛单胞菌科下某属和毛螺旋菌科下某属的丰度均显著高于室内饲养鼠兔。拟杆菌门中的黄杆菌属和金黄杆菌属、变形菌门中的假单胞菌属都是动物最常见的致病菌[43-45]，这可能是导致夏季野生鼠兔高死亡率的原因之一[46-47]。

表2 野生和室内饲养鼠兔肠道微生物在主要门和属(平均相对含量 ＞ 1%)水平上比较(平均值 ± 标准误)Table 2 Comparison of main phyla and genera (mean relative abundance ＞ 1%) of gut microbial communities in wild and laboratory-reared plateau pikas (Mean ± SE)

图2 维恩图显示野生和室内饲养高原鼠兔肠道菌群OTUs的重叠Figure 2 Venn diagram showing the overlapped OTUs of gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

维恩图结果表明，室内饲养和野生高原鼠兔肠道微生物的OTUs有49.9%是各自特有的，这可能是由于室内饲养与野生自然条件下，动物食物和环境的差异造成的。例如，对火鸡的研究发现，食物是引起驯养和野生火鸡肠道微生物差异的主要原因之一[48]。对圈养和野生斑海豹肠道菌群的研究亦表明，食物和环境是造成二者肠道微生物差异的主要原因，且圈养斑海豹肠道微生物的OTUs丰度增加[49]，与本研究结果一致。

夏季野生和室内饲养高原鼠兔肠道微生物的α多样性均无显著差异，这可能有以下几个原因。首先，宿主具有选择专一性。动物会选择环境中有利的细菌，来维持肠道微生物α多样性的稳定。高原鼠兔的肠道微生物并没有选择环境中丰度较高的细菌，而是选择环境中罕见、对宿主有益的细菌[30]。其次，微生物间的竞争。新环境中的微生物与肠道中已有微生物形成竞争关系，但新环境中的微生物很难排挤掉已有的微生物来获取生态位和资源，从而维持α多样性的稳定，导致两组肠道微生物的α多样性没有显著差异[50]。最后，某些环境罕见细菌不能吸附于肠道内，也无法在肠道内繁殖。尽管野外与室内的环境和食物条件差异明显，但野生鼠兔转移到室内后，新的微生物无法在室内鼠兔肠道内定居、繁殖。例如，在草鱼食物中加入枯草芽孢杆菌后，在其肠道中并没有检测到枯草芽孢杆菌[15]。

表3 野生和室内饲养鼠兔肠道菌群的α多样性比较Table 3 Comparison of alpha diversity of gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

图3 野生和室内饲养高原鼠兔肠道微生物基于加权UniFrac矩阵距离的主坐标分析Figure 3 Principal coordinate analysis (PCoA) of the weighted UniFrac dissimilarity metrics compared with the gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

夏季野生和室内饲养高原鼠兔肠道微生物的群落结构(β多样性)具有显著性差异，可能有两种原因。一方面，野生和室内饲养鼠兔的食物不同，食物的差异会导致肠道微生物群落结构变化[51]；另一方面，野生和室内饲养鼠兔生活环境的不同，环境微生物的不同也可能会影响肠道微生物群落结构[52]。

本研究首次比较了夏季野生和室内饲养条件下高原鼠兔肠道微生物，发现二者在微生物组成成分和群落结构上均有显著性差异，室内饲养显著改变高原鼠兔的肠道微生物，因此，室内饲养不能有效反映野生状态下高原鼠兔肠道菌群的情况。在今后开展野生动物肠道菌群研究中，需要考虑野生和实验室条件下二者的差异。