利用近红外光谱技术快速评定油菜秸秆的营养价值

闫佰鹏，王芳彬，李成海，周文静，李发弟,4，李 飞

（1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 / 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 甘肃省畜牧业产业管理局，甘肃 兰州 730070；3. 金昌居佳生态农业有限公司，甘肃 金昌 737100；4. 甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃 民勤 733300）

秸秆资源的合理、高效利用对国民生产意义重大，其具有可再生、分布广、数量多、低污染等特点，已成为可持续发展的支柱能源之一[1]。据报道，全球14%的能源是由农作物秸秆产生[2]，同时秸秆也是反刍动物主要的粗饲料来源，并为反刍动物瘤胃微生物和自身供能[3]。我国秸秆资源丰富，油菜秸秆占秸秆总量的4.2%[4]，其粗蛋白(crude protein, CP)含量优于同地区种植玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆与大豆(Glycine max)秸秆[5]。刘建胜[6]研究表明，与常规作物秸秆相比，油菜秸秆用作反刍动物饲料的比例仅为13.0%，约40%的油菜秸秆被用作燃料，造成了油菜秸秆的严重浪费。张勇等[7]用油菜秸秆型颗粒饲粮饲喂6月龄湖羊，结果表明，油菜秸秆型颗粒饲粮对湖羊健康无不良影响，同时可降低饲料成本，增加养殖效益；张吉鹍等[8]利用饲料分级指数 (GI)方法对花生 (Arachis hypogaea)藤、红薯(Dioscorea esculenta)藤与油菜秸秆等粗饲料进行评定，研究发现油菜秸秆 (GI = 0.30)低于花生藤 (GI =1.48)与红薯藤 (GI = 1.65)，但高于测定的玉米秸秆(GI = 0.20)和谷草 (GI = 0.17)，表明油菜秸秆是一种具有开发潜力的粗饲料，可作为反刍动物粗饲料来源。因此，评价油菜秸秆营养价值对反刍动物精准饲养、合理利用资源、优化饲粮配方具有生产实践意义。

NIRS (near-infrared reflectance spectroscopy)技术是20世纪70年代新兴发展的一种快速、精确、非破坏性分析技术，已被广泛应用于饲料原料营养成分分析[9]。饲料原料成分对近红外光谱具有不同吸收程度进而得到不同的近红外光谱。近红外光谱技术通过主成分分析 (priciple component analysis,PCA)、偏最小二乘法 (partial least square, PLS)、人工神经网络 (artificial neural network, ANN)等现代分析手段，建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型，从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计算[10]。目前，国内NIRS技术在粗饲料方面应用范围非常广泛，但主要集中在玉米秸秆、水稻(Oryza sativa)秸秆、小麦秸秆等常规粗饲料资源。油菜是我国的主要油料作物之一，在我国长江流域、东北地区和西北地区广泛种植，秸秆年产量达到4千万t[11]，秸秆资源丰富。但对于油菜秸秆资源利用效率低下、利用方式单一与基础研究较少是限制油菜秸秆利用的主要限制因素。因此，本研究旨在利用NIRS对油菜秸秆的营养成分建立定标模型，通过内部交叉验证与外部验证，预测NIRS技术对油菜秸秆营养价值评定的可行性，为生产实践快速评定油菜秸秆的营养价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

本研究共采集油菜秸秆样品125份，油菜秸秆样品分布信息与采样份数如表1所列。选取具有代表性、无霉变、质量为1.5～2.0 kg的整株脱籽油菜秸秆样品。将采集到的整株油菜秸秆样品铡至3～5 cm段，利用粉碎机(中型粉碎机F220)进行粉碎，过0.425 mm饲料分析筛后将样品混合均匀，装入自封袋密封保存、备用。

表1 油菜秸秆样品分布信息与采样份数Table 1 Distribution information and sample number of rape straw samples

1.2 油菜秸秆NIRS预测模型的建立

1.2.1 近红外光谱图的采集

试验采用NIRS 5000(丹麦，FOSS)近红外光谱分析仪对油菜秸秆进行近红外光谱的采集，利用配套的WinISI Ⅲ软件进行近红外预测模型的建立与验证。采集光谱时每个样品重复扫描3次，最后取平均值得到平均光谱图谱。

1.2.2 模型建立与验证

使用近红外光谱分析仪配套的WinISI Ⅲ软件进行仪器操作及光谱数据和参比数据分析，并对各个养分进行定标模型构建。样品按照4∶1的比例，随机分成定标集 (N = 100)和验证集 (N = 25)，分别用于定标模型的建立和外部验证。本研究在进行回归技术选择时，选择改进最小二乘法回归技术进行油菜秸秆近红外模型的建立。在定标过程中，为了消除无关信息与噪声对试验的干扰，利用7种去散射处理和3种导数处理对原始光谱进行预处理。模型建立过程中，根据软件建议值分别设置相应窗口，交叉验证 (cross validation groups)分组数目窗口建议值为5，超常样品删除批次 (number of outlier elimination passes)窗口建议值为 2，缺省数 (missing date value)据默认窗口建议值为 0，T 值超 常 样 品 (critical T outlier)窗 口 ， 确 认 显 示 值 为2.5，其表示当建立定标模型后利用此模型预测定标样品集。若预测结果与传统化学测定结果的差大于该定标误差的2.5倍，则被认为是T值超常样品。H 值超常样品 (critical H outlier)窗口，确认显示值为10，其定义为若样品的GH值大于10(或某样品的偏差大于定标样品集平均偏差10倍)，则将被认为是光谱值超常样品，进行剔除。

1.2.3 近红外光谱评价参数

油菜秸秆定标模型建立时，以Modified PLS与不同光谱处理方法及参数进行搭配组合进行油菜秸秆近红外模型的建立，并且通过内部与外部验证来比较模型预测值与实际测定值之间的偏离程度。定标模型建立后，用交叉验证相关系数(1 minus the variance ration, 1-VR)、 交 叉 验 证 误 差 (standard error of cross validation, SECV)和分析值与预测值的标准偏差 (standard error of calibration, SEC)3 个指标来作为定标模型优劣选择的指标。若预测模型的1-VR值越接近1，即为最佳模型；SECV可以大致评估定标模型预测的准确度，其值越小越有利于最佳模型的挑选。SEC表示分析值与预测值之间的标准偏差。对验证集评价的指标主要有定标相关系数(R squared，RSQ)、Bias为测定值与预测值之间的平均偏差和SEP即验证标准分析误差3个指标。当RSQ值较大而Bias值较小时，即为最佳模型。

2 结果与分析

2.1 油菜秸秆样品近红外光谱图

根据125份油菜秸秆样品扫描所得近红外原始光谱图 (图1)可知，油菜秸秆样品在整个光谱范围内各波长处具有不同的吸收特点，在1 450 cm-1和1 799 ～2 149 cm-1吸收强度明显增强，有强烈的吸收峰。为了消除光谱扫描包含的背景信息、噪声信息及基线漂移带来的影响，提高光谱分辨率，清楚地表明光谱的变化，图2与图3分别为油菜秸秆样品经一阶导数处理和二阶导数处理的原始光谱图。

图1 125份油菜秸秆样品近红外光谱图Figure 1 The original near infrared spectrum of 125 rape straw samples

图2 125份油菜秸秆样品一阶导数处理光谱图Figure 2 First derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

图3 125份油菜秸秆样品二阶导数处理光谱图Figure 3 Second derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

2.2 油菜秸秆营养成分近红外模型建立

2.2.1 油菜秸秆营养成分

油菜秸秆样品中DM含量变化范围为91.20%～96.39%，平均值为93.62%；CP含量变化范围为2.06%～15.92%，平均值为5.85%；NDF含量变化范围为50.51%～82.12%，平均值为67.22%；ADF含量变化范围为41.44%～65.38%，平均值为55.40%；Ash含量变化范围为4.12%～12.46%，平均值为7.66%；EE含量变化范围为0.27%～9.84%，平均值为2.57%；NDIP含量变化范围为0.50%～2.10%，平均值为1.04%；ADIP含量变化范围为0.26%～1.70%，平均值为0.63%；ADL含量变化范围为6.73%～22.33%，平均值为13.58%；NPN含量变化范围为0.01%～6.04%，平均值为1.70%；SP含量变化范围为0.46%～10.17%，平均值为2.89%(表2)。

2.2.2 不同处理方法油菜秸秆样品近红外模型选择

油菜秸秆各营养成分指标的最优组合分别为：DM 为Standard MSC 和 1，4，4，1；CP 为Weighted MSC 和 2，4，4，1；NDF 为 SNV 和 2，4，4，1；ADF为 Detrend和 2， 4， 4， 1； EE为 Inverse MSC 和 2， 4， 4， 1； Ash为 SNV and Detrend和1，4，4，1；NDIP 为 Weighted MSC 和 2，4，4，1； ADIP为 Detrend和 1， 4， 4， 1； ADL 为SNV 和 2，4，4，1；NPN 为 Weighted MSC 和 1，4，4，1；SP 为 Weighted MSC 和 1，4，4，1(表 3)。各营养成分指标所对应的SECV和1-VR值分别为：DM 为0.326 2 和0.912 0，CP 为0.325 2 和0.990 8，NDF 为 1.762 5 和 0.900 4，ADF 为 3.856 6 和 0.709 8，EE 为 0.352 5 和 0.974 2，Ash 为 0.471 3 和 0.913 5，NDIP 为0.239 6 和0.442 7，ADIP 为0.122 1 和0.675 9，ADL 为 1.498 6 和 0.458 2，NPN 为 0.377 5 和 0.924 6，SP 为 0.612 8 和 0.928 5。

表2 油菜秸秆营养成分Table 2 The nutrient content of rape straw

表3 油菜秸秆各营养成分指标最佳定标模型Table 3 Optimal NIRS prediction models for nutrition index of rape straw

2.3 油菜秸秆营养成分近红外模型的验证

2.3.1 验证集油菜秸秆样品营养成分

油菜秸秆验证集所用样品数为25份。用于外部验证的油菜秸秆样品各营养成分的含量，DM含量变化范围为91.82%～95.92%，平均值为93.62%；CP含量变化范围为2.26%～11.00%，平均值为5.54%；NDF含量变化范围为54.55%～78.52%，平均值为70.47%；ADF含量变化范围为39.76%～65.30%，平均值为56.00%；Ash含量变化范围为4.91%～9.50%，平均值为7.28%；EE含量变化范围为0.46%～6.06%，平均值为2.27%；NDIP含量变化范围为0.67%～1.88%，平均值为1.02%；ADIP含量变化范围为0.19%～1.29%，平均值为0.64%；ADL含量变化范围为10.39%～18.92%，平均值为13.62%；NPN含量变化范围为0.36%～4.59%，平均值为1.34%；SP含量变化范围为0.64%～6.86%，平均值为2.53% (表4)。

2.3.2 油菜秸秆各营养成分最佳模型验证结果

油菜秸秆 DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash、NDIP、ADIP、ADL、NPN和SP成分的最佳定标模型内部验证RSQ值分别为0.901、0.938、0.586、0.710、0.922、0.788、0.392、0.580、0.379、0.794、0.827， Bias值 分 别 为 -0.047、 -0.117、 -0.038、0.049、 -0.024、 -0.046、 0.029、 0.016、 0.081、-0.105、0.213；外部验证 RSQ值分别为 0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，Bias值分别为-0.093、-0.035、2.275、 -0.398、 -0.008、 -0.149、 0.030、 0.008、-0.153、-0.222、-0.104(表 5)。

表4 验证集油菜秸秆营养成分含量Table 4 The result of nutrient content of rape straw in validation set

表5 最佳定标模型验证结果Table 5 The result of best calibration model validation

3 讨论

20世纪70年代Norris等[12]使用近红外光谱技术测定了苜蓿(Medicago sativa)、高羊茅(Festca arundinacea)等饲草原料中CP、NDF与ADF等的含量，证实了近红外光谱技术用于快速评定饲草质量的可行性。迄今，随着近红外光谱技术的不断发展与完善，NIRS已被更加广泛的应用于饲料常规营养成分、肉品质及乳品质分析的研究中[13-15]，进一步肯定了NIRS对饲料营养价值评定、畜产品安全评定的可行性，推动了畜牧业的快速发展。

NIRS技术的测定结果会受到样品因素、参比值的准确性、仪器的稳定性及操作环境等诸多因素的影响[16-17]，其中样品因素尤为重要，因此采集样品需具有代表性；史永刚等[18]研究指出待测样品的代表性和湿化学分析结果会对近红外分析结果准确性产生较大影响，本研究采用的采样方法和营养成分测定方法为国家标准方法或公共认可方法，测定过程中进行多次重复，平行测定值之间的误差均在所要求范围内，其中CP、EE、SP、NPN测定结果的变异系数较大，高于50%，其余各指标测定结果变异系数均较小。

大量学者利用NIRS分析技术评定饲料营养价值且该技术已是测定饲料营养成分的方法之一。Yang等[19]利用NIRS技术对我国西南地区的燕麦(Avena sativa)进行了饲料化学品质的测定，测定项目主要包括CP、ADF、NDF与水溶性碳水化合物(WSC)，结果表明对于CP、NDF、ADF与WSC含量的最佳模型其波长位置为 4 247～6 102 cm-1、4 247～ 5 450 cm-1、 5 446～ 6 102 cm-1和 4 247～4 602 cm-1，且预测值与测定值具有较高的相关性(R2CV, CP = 0.99，NDF = 0.94，ADF = 0.92，WSC =0.88)，其指标模型可用于日常分析。Asekova[20]以不同品种的大豆(N = 353)为研究对象，对CP、CF、NDF和ADF利用NIRS技术构建模型，研究结果表明CP、CF最佳定标模型所对应的光谱处理和参数为 (2，5，5，1; MSC)，NDF 和 ADF 最佳定标模型所对应的光谱处理和参数为(1，4，4，1; MSC)，其构建模型可以用于大豆营养价值的预测；刘贤等[21]以158个不同种类的青贮秸秆饲料为研究对象，利用近红外反射光谱技术建立了常规营养成分含量的定量校正分析模型，研究发现常规营养成分校正模型的R2≥ 0.86，可以用于快速测定秸秆青贮饲料的营养成分；白琪林等[22]与邰书静等[23]均以玉米秸秆为试验材料，构建玉米秸秆ADF、NDF含量的NIRS分析模型，其NDF和ADF近红外校正模型校正系数均大于0.90；以上大量研究均表明，NIRS技术已广泛用于饲料原料营养成分分析中，同时验证了NIRS对饲料营养价值评定的可行性，本研究油菜秸秆定标模型的各营养成分指标所对应的1-VR值除NDIP、ADIP和ADL指标外，其余各指标1-VR均在0.9左右；内部验证RSQ 值 分 别 为 DM 0.901，CP 0.938， NDF 0.586，ADF 0.710， EE 0.922， Ash 0.788， NDIP 0.392，ADIP 0.580，ADL 0.379，NPN 0.794，SP 0.827；外部验证RSQ值分别为0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，通过以上结果可以看出，内部验证结果优于外部验证结果，这可能与饲料样品的性质、实验室测定值的误差以及所选取的外部验证样本数有关，在后续研究中应当注意样本数对外部验证结果的影响[24]。在本研究中，油菜秸秆DM、CP、ADF、EE、Ash、NPN和SP等营养成分的校正模型是可用的，其余营养成分利用NIRS技术进行检测的可行性需进一步研究。

4 结论

本研究利用近红外光谱分析技术对油菜秸秆样品的营养成分进行测定，建立了近红外定标模型，同时筛选出各营养成分最优组合，DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash和 SP的 1-VR均在 0.9左右，所构建的NIRS模型可用于日常分析。然而，NDIP、ADIP和ADL所构建NIRS模型效果不太理想，需进一步优化模型。NIRS可以作为可靠、快速的分析工具，取代耗时耗力的湿化学分析方法，是一种廉价、绿色安全的分析技术，在动物营养方面，能够及时掌握、调整饲粮配方进而使得动物生产性能最大化。