转录组学在牧草上的应用进展

王 飞，刘林波，高天歌，高 鲤，包爱科，王锁民

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院, 甘肃 兰州 730020）

转录组(transcriptome)是在某一生理条件下，生物体细胞内特定组织或器官转录出来的所有RNA产物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA以及非编码RNA[1-2]。转录组学(transcriptomics)适用于在整体水平上研究细胞中基因转录情况及调控规律，包括非编码区域功能研究、转录本结构研究、基因转录水平研究和全新转录区域研究[3]。转录组测序即RNA测序(RNA-Seq)，指利用高通量测序技术进行cDNA测序(RNA-seq)[2]。相较于传统的基因芯片测序[4]，RNA-Seq可全面并准确地测定出多细胞生物整体转录活动，已被应用于生物学研究及医药研究的多个领域。在植物方面，随着测序技术的发展，转录组测序在玉米(Zea mays)[5-8]、小麦(Triticum aestivum)[9-12]、水稻(Oryza sativa)[13-15]以及大豆(Glycine max)[16-18]等作物研究中已有广泛的应用。牧草是供牲畜饲用的草或其他草本植物，是畜牧业能够快速稳定发展的基础。近年来，转录组测序在牧草种质资源评价、重要性状形成机制以及优异基因资源挖掘、分子标记开发等方面已开始应用，并取得了一系列重要进展。本研究从高通量测序技术的发展及转录组测序在牧草生长发育、生物胁迫适应机制、非生物胁迫(盐碱、极端温度、干旱、营养亏缺、重金属等)适应机理、逆境转录因子挖掘和分子标记开发等方面对相关研究进行综述，以期为牧草种质资源的开发与利用、优异基因的挖掘和牧草分子育种提供一定的依据。

1 高通量测序技术的发展

高通量测序技术又称深度测序(deep sequencing)技术，包括第二代测序技术(new sequencing technologies)[19]和单分子测序技术，可以同时对上百万个DNA分子进行测序，使得对一个物种的基因组和转录组的全面分析成为可能，是测序技术发展史上的一个重要里程碑。

1.1 第二代测序技术

随着人类基因组测序工程及模式生物基因组测序的完成，重测序技术开始被应用。传统的测序已经不能完全满足研究的需要，因此出现了费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，被称为“第二代测序技术”。第二代测序技术包括Roche/454[20]、Illumina[21]、美国应用生物系统公司的SOLiD[22]与HelicosHeliScope[23]。四大测序平台各有其优缺点：Roche/454的测序原理为焦磷酸合成测序，平均读长 400 bp，数据量 0.5 Gb·run-1，准确率 ≥ 99%，读长最长，运行速度快，但试剂花费高且同源重复序列出错率较高[24-26]；Illumina的测序原理为可逆染料终结合成测序，平均读长100 bp，数据量54～60 Gb·run-1，准确率 98%～99%，性价比高，是目前应用最广泛的平台，但读长短[25-27]；SOLiD的测序原理为连接测序，平均读长50 bp，数据量100 Gb·run-1，准确率 ≥ 99.94%，准确率最高但是读长短 、 运 行 时 间 长[25-26, 28]； Helicos HeliScope 的 测 序原理为单分子合成测序，平均读长35 bp，数据量21～35 Gb·run-1，准确率 97%～99.8%，产量高、文库制备简单，不需要DNA扩增或连接，但失误率高[25-26, 29]。二代测序技术的到来极大地减少了测序成本、降低了试验的复杂性，同时提高了转录本的覆盖度，使得基于转录组分析测序在科学研究中更加可行和有用，其已被广泛应用于新基因的发掘、标记基因的开发、转录图谱的绘制和生物代谢途径的确定等诸多领域。

1.2 单分子测序技术

虽然第二代测序技术已被应用到科学研究的多个领域，但也存在着许多的不足。如，测序读长较短[30]，扩增后得到的DNA分子片段的数目与扩增前相比有相对偏差[31]，这些缺点在一定程度上限制了第二代测序技术的应用和发展。随着测序技术的进一步发展，出现了第三代测序技术。第三代测序技术即单分子测序技术，采用分子读取技术，读取数据速度更快的同时不需要PCR扩增步骤，从而降低了测序的成本，其测序平台主要有Helicos biosciences 公司的 tSMSTM(true single molecular sequencing)技术平台、美国 Pacific Biosciences 公司的 SMRT(single molecule real-time)技术平台、美国Life Technologies 公司的基于 FRET 测序技术以及美国 Ion Torrent 公司与英国 Oxford NanoporeNechnologies公司的纳米孔单分子技术[32-33]。由于第三代测序技术相比于第二代测序技术具有更高的通量、相对便宜的测序仪器和试剂以及更加简单的操作，已被应用于基因组测序、突变鉴定、RNA测序、重复序列和PolyA结构的测序及医学领域。

2 转录组测序在牧草生长发育研究中的应用

植物的生长发育是一个极其复杂的过程，在各种物质代谢的基础上表现为种子萌发、营养生长、生殖生长以及植物体的死亡。对牧草而言，牧草产量和营养品质与植物的生长发育是密不可分的。要获得高产、营养品质优良的牧草，最有效的途径之一就是从牧草的生长发育研究入手，挖掘它们自身中与各种代谢途径密切相关的基因，并利用这些基因对牧草进行遗传改良。目前，转录组测序在牧草生长发育机制研究中已得到了广泛的应用。

Zhang等[34-35]测定了两个不同品种(休眠和非休眠性)紫花苜蓿(Medicago sativa)在不同时间点的转录组，分析得到了与紫花苜蓿秋眠性相关的一些基因，为解析苜蓿的秋眠性机理提供了一定的参考。Martin等[36-37]对C4模式植物狗尾草(Setaria viridis)分生组织、细胞过渡、扩张和成熟区分别进行了转录组测序分析，得到了其完整的基因表达和代谢产物图谱，同时他们还通过对狗尾草茎节间的RNA-seq测序分析，为探究狗尾草生长发育过程中茎节间细胞壁沉积的基本生理与分子机制提供了依据。张曼[38]运用转录组测序技术测定了在超高浓度CO2中生长的狗尾草叶片，并同正常条件下生长的狗尾草转录组数据进行比较分析，筛选得到了参与糖代谢、光合作用、氧化还原反应和胁迫刺激反应等生物学过程的174个差异基因，此结果为解读C4植物响应超高浓度CO2的分子机制提供了帮助。这些研究有助于从分子水平上对牧草的生长发育进行认识，并可通过这些差异基因对牧草进行遗传改良。

3 转录组测序技术在牧草抗逆机制研究中的应用

环境因子和病虫害等严重影响牧草的正常生长发育和产量。研究植物抗逆机制并利用基因工程的方法培育抗逆植株具有重要意义。目前，转录组测序在牧草抗逆机制研究中已得到了广泛的应用(表1)，以下将对相关研究进行综述。

表1 已应用转录组测序研究抗逆机制的牧草种类Table 1 Species of forage that have studied the mechanism of stress resistance by transcriptome sequencing

3.1 牧草对生物胁迫的适应机制

与其他植物一样，牧草遭受到病原微生物的侵害后会发生新陈代谢紊乱，进而影响其生长发育、产量与品质。当前，通过高通量测序技术，从牧草转录组中筛选与抗病原微生物侵入相关的基因并利用分子生物技术进行遗传控制，已成为防治牧草病害的有效途径之一。Wichmann等[39]对被半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens)侵染的抗细菌性枯萎病(bacterial wilt)和易感病的两种意大利黑麦草(Lolium perenne)在不同时间点的转录组进行了分析比较，发现被病菌侵染后，抗病型意大利黑麦草中有一些基因的表达量发生了变化，说明它们可能与意大利黑麦草抗细菌性枯萎病有关，此研究结果有助于黑麦草分子标记辅助抗病育种相关工具的开发与利用。褐斑病(brown spot)是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的一种真菌病害，Zhu等[40]通过转录组测序分析研究了立枯丝核菌AG1侵染结缕草(Zoysia japonica)栽培种“Zenith”根部后两者之间存在的早期相互作用，揭示了立枯丝核菌与结缕草在侵染初期两者相互作用过程中的表达谱，此研究对立枯丝核菌AG1-IA 关键致病性的鉴别起到了很大的帮助。

过度放牧导致牧草产量下降甚至植物死亡，易引起草原植被破坏和沙漠化，严重阻碍了畜牧业的发展。如何提高牧草的耐牧能力，最大限度的提高牧草效益，是畜牧业亟待解决的问题之一。Liu等[41]利用RNA-seq测序技术分别测定了用牛唾液处理4、8和24 h后紫花苜蓿叶片的转录组数据，共得到4 814个差异表达基因，通过聚类、GO以及KEGG富集鉴定并分析这些基因发现它们在响应唾液沉积中起到了潜在的作用，并且这些基因的表达量在“亚油酸代谢”、“植物-病原体相互作用”、“a-亚麻酸代谢”、“植物激素信号传导”和“核糖体”通路中都有明显的增加，此研究不仅可以加深对苜蓿与唾液沉积之间复杂相互作用的理解，而且还将有助于了解植物对草食动物放牧的响应机制，以及利用育种手段对牧草进行遗传改良提供了潜在的目标。石红霄[42]采用HiSeqTM 2500高通量测序技术分别对高原早熟禾(Poa alpigena)矮化和正常植株进行了转录组测序分析，筛选得到了在放牧条件下的高原早熟禾体内与光合作用途径、叶绿体光合代谢途径、氧化磷酸化途径、蛋白酶、过氧化物酶、脂肪降解以及Notch 信号途径等富集差异通路相关的差异基因，并且发现这些功能差异基因与高原早熟禾适应放牧胁迫的能力密切相关。这为利用分子手段改善牧草的耐放牧能力提供了一定的借鉴。

综上所述，转录组测序在牧草抗病性和耐牧性上已有应用，但在抗虫害和鼠害等方面应用甚少。随着测序技术的不断发展，通过转录组测序分析，筛选出一些与牧草抗病虫害等生物胁迫相关的基因，并利用分子手段通过这些关键基因对植物进行遗传改良，是提高牧草产量和品质的有效途径之一。

3.2 牧草对非生物胁迫的适应机理

各种非生物胁迫因子影响牧草的正常生长，造成草产量下降、牧草品质降低，甚至植物的死亡。目前，高通量测序技术在研究牧草适应非生物胁迫上已得到了广泛的应用。通过转录组数据分析，可筛选得到与植物适应非生物胁迫相关的关键基因，并利用其对抗性差的品质进行遗传改良，从而有效提高牧草适应非生物胁迫的能力。转录组测序在牧草适应非生物胁迫方面的研究主要集中在植物耐盐碱、耐极端温度、抗旱、营养元素亏缺及重金属毒害抗性等方面。

3.2.1 抗盐碱机制

盐碱会影响牧草苗期及生长期的正常生长发育，造成植物体内养分吸收、利用和分配的不平衡，并产生离子毒害作用[43]。转录组测序分析可为耐盐碱牧草品种的选育与生产提供一定的科学依据，尤其在紫花苜蓿耐盐碱机制的研究上应用最为广泛。An等[44]利用离子激流测序技术分别分析了在盐碱溶液中生长0、1和7 d后的紫花苜蓿幼苗的整株转录组，发现在处理1和7 d后分别有2 286和 2 233个差异表达基因，有109和 96个转录因子发生了显著地变化，同时通过测定生理指标发现活性氧清除系统、丙二醛和叶绿素含量等都发生了明显的改变，此研究为探究紫花苜蓿适应盐碱胁迫的生理与分子机制提供了新的思路。Gruber等[45]通过分析和比较两种新型耐盐性南美紫花苜蓿转录组数据，选择出更为耐盐的新品种；陈冉冉等[46]通过大豆碱胁迫转录组数据筛选到一个在碱胁迫下上调表达的假定蛋白基因GsARHP(alkali stress related hypothetical protein gene)，并证明了GsARHP基因的超量表达可以增强紫花苜蓿的耐碱能力；马进等[47]利用转录组测序技术发现紫花苜蓿根系对盐胁迫的响应是多基因参与、多个生物代谢过程反应协同调控的过程，基因表达量的变化可能是调控的主要方式；张婧蕾等[48]以南方型紫花苜蓿耐盐突变体为材料，通过转录组数据分析同样鉴定出了苜蓿中与盐胁迫应答相关的差异表达基因。

除了紫花苜蓿，转录组学还应用于霸王(Zygophyllum xanthoxylum)、羊草 (Leymu schinensis)以及鹰嘴豆(Cicer arietinum)等其他草类植物对盐碱胁迫响应的研究中。Ma 等[49]首次对 50 mmol·L-1NaCl胁迫处理下的多浆旱生植物霸王进行转录组测序，共得到106 423条Unigenes序列，通过数字基因表达谱分析表明在盐和渗透胁迫下，霸王的根、叶中与离子转运、光合作用途径以及活性氧清除系统相关基因的表达丰度都有明显的上调，并鉴定出了霸王响应盐胁迫的关键基因，为干旱地区重要栽培牧草和作物品种抗逆性的遗传改良提供了丰富的遗传资源。Sun等[50]分别构建了在空白 对 照 以 及 100 mmol·L-1NaCl与 200 mmol·L-1NaHCO3处理下羊草的cDNA文库，利用Roche-454对这两个不同的cDNA文库进行了大规模焦磷酸合成测序和分析，得到了同对照相比在盐碱处理下的36 497个上调表达基因和18 218个下调表达基因，通过基因注释和通道富集分析发现这些差异基因主要与羊草胁迫响应、信号转导、能量生产和转换以及无机离子转运有关。Molina等[51]利用深度 SAGE 测定了在 25 mmol·L-1NaCl处理下鹰嘴豆的转录组，分析筛选得到了同活性氧清除系统以及Na+平衡相关的差异表达基因，为耐盐品种的培育提供了一定的依据。

3.2.2 对极端温度的适应机理

极端温度胁迫包括低温胁迫与高温胁迫，是危害牧草的主要环境胁迫之一，严重损害了牧草的生长和生产潜能。目前转录组学在这方面的研究主要集中在牧草适应低温胁迫及冷驯化上，在其适应高温胁迫方面的研究较少。张美萍等[52]通过对l6个紫花苜蓿中逆境应答Ca2+-ATPase家族的转录组数据分析，发现多数紫花苜蓿Ca2+-ATPase家族基因受低温和冷冻胁迫的诱导表达，为揭示苜蓿在低温冷害应答中的功能提供了重要的参考。颜朗等[53]通过转录组数据分析揭示了皇竹草(Pennisetum sinese)的抗冻特性，对热带引种植物分子育种的开展提供了参考；付娟娟[54]采用RNA-seq高通量测序技术，探究了西藏野生垂穗披碱草(Elymus nutans)在低温胁迫下的基因表达响应，揭示了其适应低温的分子机制；Abeynayake等[55]在对适应不同气候类型的两种不同基因型多年生黑麦草(Lolium perenne)进行低温驯化17 d后，分离出这两种多年生黑麦草在不同时间点的总RNA，通过Illumina测序并分析，结果表明在低温驯化中，这两种不同基因型的多年生黑麦草响应低温胁迫的昼夜节律网受到了干扰，揭示了多年生黑麦草在低温驯化中的分子机制。曹路等[56]利用Illumina测序技术对多年连续模拟增温处理的荒漠草原区短花针茅(Stipa breviflora)在果后营养期进行了转录组测序，分析得到了 131 779 个 hranscript和 54 075条 Unigenes，并将 1 791个 DEGs在 151个代谢通路中进行了注释，此研究为保护野生饲草的种质资源提供了一定的试验依据。

3.2.3 抗旱机制

干旱也是影响牧草生产力的主要环境因素之一，通过转录组测序探究牧草适应干旱胁迫机制的报道不是很多。冷暖等[57]采用高通量Illumina测序平台对在对照和干旱处理下的草地早熟禾(Poa pratensis)进行转录组测序并分析，共检测得到24 465个差异表达基因，其中有4 143个上调基因和4 415个下调基因，通过富集分析发现了与蛋白激酶、蛋白磷酸酶、碳代谢以及ABA等草地早熟禾干旱响应机制相关的基因，此研究为揭示草地早熟禾应答干旱胁迫的分子机制奠定了基础。Ma等[49]通过对-0.5 MPa渗透胁迫处理下的霸王进行了转录组测序，鉴定出了霸王响应干旱胁迫的关键基因，为干旱地区重要牧草和作物品种抗逆性的遗传改良提供了丰富的遗传资源。

3.2.4 对矿质营养亏缺和重金属胁迫的适应机制

Byrne等[58]利用微阵列(microarray)测序技术研究了在缺磷(P)条件下生长的多年生黑麦草中基因的表达情况，并进行了气相色谱-质谱代谢图谱分析，结果发现在磷缺乏24 h后，多年生黑麦草的代谢产物和转录本都发生了明显的变化，表明了多年生黑麦草主要是通过磷脂的替代和糖酵解旁路来响应缺磷胁迫的。丁氏清茶[59]测定分析了在镉(Cd)处理下的甜高粱(Sorghum bicolor)转录组，分别在甜高粱茎和叶中得到了668和286个差异表达基因，并且通过检测得到了35个与重金属转运蛋白及解毒相关的显著表达基因，此研究为进一步研究植物在镉污染土壤中自身修复的基因网提供了参考。Montero-Palmero 等[60]将在3 μmol·L-1汞(Hg)处理3、6和24 h后紫花苜蓿根全基因组转录谱同蒺藜苜蓿(M. tructunla)微阵列进行比较分析，发现在紫花苜蓿根中有559个差异表达基因且有91%的基因表达上调，而且大部分基因在汞处理3和6 h后都有所表达，它们主要同植物胁迫响应、次级代谢和激素代谢有关。同时还发现乙烯参与了苜蓿对汞胁迫的早期响应，调节了根系生长抑制、NADPH-氧化酶活性和汞诱导的H2O2积累。Liu等[61]利用Illumina测序分析了在铝(Al)胁迫4、8和24 h后紫花苜蓿根中转录组的变化情况，共得到2 464个差异表达基因，而且大多数都是在胁迫早期(4 h)和晚期(24 h)时表达上调，通过代谢通路富集分析发现这些差异基因参与了核糖体和蛋白质的生物合成与加工、柠檬酸循环、膜转运以及激素调节，说明紫花苜蓿体内解毒机制在铝胁迫中发挥了重要的作用，此结果有助于了解苜蓿响应铝胁迫的分子机制。

这些研究有助于对牧草响应矿质元素缺乏和金属离子胁迫的分子机制的了解，并为在重金属污染地区植物适应性改良提供新的思路。

4 分子标记开发

4.1 SSR分子标记

随着分子技术的快速发展，DNA分子标记作为一种全新的鉴定方法，由于其简单高效、成本低且重复性好等优点，已被普遍应用于物种和品种的鉴定，其中简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)分子标记应用最为广泛。SSR标记，又称为微卫星 DNA (microsatellite DNA)标记，是一种新兴的分子标记技术。SSR大量存在于真核基因组中，其多态性高、技术重复性好、易于操作。随着生物学技术的不断发展，植物表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)已 经 成 为 了 开 发SSR分子标记的重要资源，EST-SSR标记广泛应用于植物遗传育种、品种鉴定、种质资源保护和DNA 指纹图谱建立等方面[62-63]。牧草中的EST-SSR标记开发已得到了越来越多的研究者的关注，截至目前已有多种物种通过转录组测序开发了ESTSSR分子标记，如紫花苜蓿、老芒麦(Elymus sibiricus)、狗尾草、羊草、箭筈豌豆(Vicia sativa)以及无芒隐子草(Cleistogenes songorica)。

陈天龙[64]利用紫花苜蓿转录组测序结果开发了107对EST-SSR引物，为苜蓿育种研究的开展奠定了基础。Liu等[65]通过转录组测序在紫花苜蓿中也开发出了EST-SSR标记，促进了与苜蓿有关的遗传和分子育种研究的发展。Zhou等[66]利用IlluminaHisSeq 2 000测序平台对老芒麦愈伤组织、幼根和幼苗等11个不同组织进行了转录组测序，根据测序结果开发了112个具有多态性的ESTSSR分子标记，并揭示了这112对引物在E. abolinii和E. antiquus等13个披碱草属物种中的通用性，推动了老芒麦以及披碱草属植物的遗传多样性和分子标记辅助育种。Xu等[67]利用第二代测序技术测定分析了狗尾草不同发育时期不同组织和器官的转录组，以狗尾草基因组42 754个转录本为参考，组装后共得到60 751个转录本，分别在参考组和转录组中鉴定出了9 576和 7 056个SSR标记，这些SSRs标记的发现为狗尾草的遗传学研究提供了一定的帮助。Chen等[68]从羊草转录组87 214 个 Unigenes中鉴定出了 3 818 个 EST-SSR 标记，并分析了这些SSRs的核苷酸重复序列和主要显性序列，发现三核苷酸序列在羊草SSRs中比例最高(74.12%)，且CCG序列在三核苷酸序列中占主导地位，其次是AGG和AGC，二核苷酸序列主要为AG和AC，这与在小麦和大麦(Hordeum vulgare)中的结果类似。他们还发现了109个包含ESTSSR且与冷响应相关的Unigenes，它们主要编码转录因子和蛋白激酶等调节蛋白。此研究结果丰富了羊草的转录组，为其分子育种提供了宝贵的资源。Liu等[69]从箭筈豌豆转录组中超过1 000 bp长度的1 025个 Unigenes中鉴定得到了1 071个潜在的EST-SSR标记，并设计合成了450对引物，最终对10个箭筈豌豆种质开发了95对多态性引物，其中包括50个独立引物。这95个EST-SSR标记的开发促进了箭筈豌豆遗传和分子育种的研究。Zhang等[70]构建了在干旱胁迫下无芒隐子草叶和根的cDNA文库，对5 664个随机cDNA克隆进行表达序列标签(EST)测序后共得到3 579个高质量的修剪序列，修剪后的ESTs平均长度为613 bp，并且在这些ESTs中发现了161个SSR。该研究中构建的cDNA文库和得到的ESTs有助于了解无芒隐子草抗旱性的潜在分子机制(表2)。

表2 应用转录组测序开发了分子标记的牧草种类Table 2 Species of forage that have developed the molecular marker by transcriptome sequencing

4.2 SNP分子标记

SNP (single nucleotide polymorphism)标 记 ， 即单核苷酸多态性标记，指在基因组上由单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富，是目前遗传标记中研究最多和最有前景的分子标记。Lander[75-76]在1996年正式指出SNP开启了分子标记新时代，该分子标记是在以SSR和ISSR为代表的第二代分子标记基础上发展起来的第三代分子标记技术。SNP标记作为目前最具发展潜力的分子标记，适合于数量庞大的检测分析，已被广泛应用于生物、农学、医学、生物进化等众多领域[77]。同EST-SSR相比，SNP标记在牧草中的研究不是很多。Li等[71]通过转录组测序，研究了27种不同基因型苜蓿中的SNPs，发现在优良紫花苜蓿繁殖种群中存在大量的单个SNPs标记，而在未改良的紫花苜蓿种质中SNP的多样性明显较低。Yang等[72]通过转录组数据分析，发现SNP和候补基因的鉴定有利于紫花苜蓿在饲料与纤维素方面的改良。Studer等[73]利用二代测序技术鉴定了多年生黑麦草中的SNPs，该研究是多年生黑麦草SNP标记基因的发现和相应的转录序列遗传确立的重要里程碑，并为其遗传育种提供了一种新的策略。Huang 等[74]通过 IlluminaHiSeq 2 000 测序平台测定了两种不同基因型的鸭茅(耐热型和热感型)转录组，并从中鉴定得到了基因相关分子标记包括SSRs和SNPs以及热应激差异表达基因，此研究说明转录组测序为SNPs和SSRs开发和利用提供了有用的分子信息。

5 展望

转录组测序是分析基因表达差异、基因结构变异、筛选分子标记、完善和优化基因结构、鉴定可变剪接体以及RNA编辑的重要手段。相较于传统芯片，转录组测序不需要预先设计探针便可对任意物种的任意组织和细胞进行测序，可以提供更准确的数字化信息、更高的检测通量和更广泛的检测范围，已广泛应用于代谢工程、医药和植物细胞特性改造等诸多领域。

目前，第二代测序在牧草生长发育、抗生物胁迫和非生物胁迫机制研究、优异基因资源的挖掘以及分子标记方面已得到了较为广泛的应用，为优良牧草新品种的培育提供了理论指导。但当前已完成转录组测序的牧草种类仍然较少，而且在牧草品质性状、基因优化及利用转录组数据进行ILP分子标记以及LTR分子标记的开发等方面的研究甚少。为了达到更高的测序精确度、更大的测序通量、更短的测序时间以及更低的测序成本，出现了第三代测序技术即单分子测序，其不需要进行PCR扩增即可在单分子水平上进行检测。虽然目前单分子测序技术在牧草研究上还不够成熟，但随着生物技术的不断发展，第三代测序技术势必会在牧草研究上得到广泛的应用，为牧草种质资源的开发与利用、牧草分子育种以及牧草优异抗逆基因的挖掘提供更加准确的参考，必将为推动畜牧业的健康和可持续发展做出更大的贡献。