通过式高效净化-超高效液相色谱-串联质谱测定猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂

李晓丹 汪建妹 王向军 杨华 吉小凤 徐杰 钱鸣蓉

摘 要 建立了猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。样品经乙腈提取，浓缩后加水混匀， 经PRiME HLB柱净化，收集流出液， 用UPLC-MS/MS法测定，基质标准曲线定量。21种三唑类杀菌剂在0.5～100 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99; 在3个添加浓度（2.0、5.0和10.0 μg/kg） 下，各杀菌剂的回收率为69.5%～109.5%，相对标准偏差为0.4%～10.8%。 此方法前处理操作简便，灵敏度高， 精密度好，能较大程度除去基质干扰，可用于猪肉、猪肝及其脂肪组织中21种三唑类杀菌剂残留的测定。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱; 猪肉; 猪肝; 猪脂肪; 三唑类杀菌剂

1 引 言

三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，结构主链上含有羟基（酮基）、取代苯基和1，2，4-三唑基团，作为一类高效、低毒、广谱的杀菌剂[1]， 广泛用于蔬菜、水果、稻谷作物等种植与病虫害防治[2]，但同时也造成其在蔬菜、水果、农作物、土壤和水体[3～5]中残留，影响食品质量安全并造成环境污染[6]。残留的杀菌剂及其代谢物可通过食物链传递，在动物组织中富集、累积，使畜禽产品也存在安全隐患，对消费者的健康造成威胁。日本“肯定列表制度”[7]及国际食品法典委员会（CAC）[8]针对畜禽产品中的部分三唑类杀菌剂设定了最大残留限量（MRL），范围在0.01～2.00 mg/kg之间。我国食品安全标准GB2763-2016中仅规定了部分三唑类杀菌剂在植物性食品中的限量标准[9]，尚未对动物性食品中残留作限定。

目前，文献报道的关于三唑类杀菌剂残留的测定主要集中在水体、土壤及水果、蔬菜等植物性样品，样品净化通常采用QuEChERS方法[10～12]、固相萃取方法（SPE）[13～17]或分散液液微萃取法（DLLME）[3，18，19]等，检测方法有气相色谱法[14]、液相色谱法[16，17]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[13～15，18]和液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）[17，19]等。现行关于三唑类杀菌剂的检测技术标准[20～22]涉及的基质以粮谷类、果蔬等植物性食品为主，净化方式均采用固相萃取技术，关于畜禽产品中三唑类杀菌剂的检测方法较少，缺乏相应完善的检测技术标准。对于动物性食品的残留分析方法通常采用较为繁琐的SPE柱净化或QuEChERS法结合其它技术，Souza等[23]通过改良QuEChERS法结合冷冻除脂后用HPLC-MS/MS和GC-MS检测肝脏、肌肉中的兽药和杀虫剂。吕冰等[24]采用乙腈提取，以凝胶渗透色谱和Carb-NH2萃取柱联合净化， 建立肉类、水产类等动物性食品中167种农药残留的气相色谱-串联质谱检测方法。本研究将针对猪肉、猪肝、猪脂肪基质中脂肪、蛋白含量高，采用通过式过柱法去除脂肪和磷脂，净化效率高、操作简便，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定，方法灵敏度高、重复性好，可以满足畜禽产品中三唑类杀菌剂的测定要求，为动物源食品的残留监测与控制提供技术支撑。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS配置包括LC 30AD超高壓液相色谱（日本Shimadzu公司）与6500 QTRAP质谱（美国Applied Biosystems公司），并配备Multiquant 3.0数据处理软件; 固相萃取装置（美国Supelco公司）; Talboys230v涡旋混合器（美国Troemner公司）; SorvallPrimoR高速冷冻离心机（美国Thermo公司）; KQ5200B超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）; 分析天平（德国Sartorius公司）; Turbovap LV氮吹浓缩仪（瑞典Biotage公司）; 组织捣碎机（荷兰Philips公司）。

固相萃取柱为Oasis  PRiME HLB（200 mg，6 mL，Waters公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）。甲酸铵（色谱纯，迪马公司）。实验用水为超纯水（美国Millipore公司）。三唑类杀菌剂标准品（纯度均≥98%，名称见表1）购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

准确称取按其纯度折算为100%质量的21种三唑类杀菌剂标准品各10 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度为100 mg/L，储备液储存于20℃，有效期为12个月。用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准工作溶液，混合标准工作溶液保存于4℃，现配现用。

2.2 样品处理

2.2.1 样品制备 猪肉、猪肝和猪脂肪样品购自本地农贸市场，样品先切碎成小块，随后用组织捣碎机捣碎成匀浆，置于分装袋中， 20℃下保存备用。

2.2.2 样品前处理 称取5 g（精确到0.01 g）试样至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混合，超声提取5 min，以8000 r/min离心3 min，收集上清液，残渣用10 mL乙腈进行二次提取。合并两次提取液，于50℃水浴中氮吹至4 mL，然后用水定容至5 mL，涡旋混匀，过PRiME HLB柱净化，重力作用下，收集全部流出液。取1 mL流出液，以水定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，待测。

2.3 色谱和质谱条件

色谱条件： BEH-C18柱，（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）; 柱温：  40℃; 进样量： 5 μL; 流速： 0.2mL/min; 流动相A为2 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B为甲醇，梯度洗脱程序： 0～1 min，70% A; 1～1.1 min，70%～40% A; 1.1～3 min，40% A; 3～8 min，40%～10% A; 8～12 min，10% A; 12～12.1 min，10%～70% A; 12.1～15 min，70% A。

质谱条件： 电离模式： 电喷雾电离（ESI+）; 扫描方式： 多反应监测; 喷雾电压： 5.0 kV; 气帘气： 40 psi （氮气）; 离子源温度的550℃; 雾化气： 50 psi; 辅助加热气： 55 psi。质谱参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 色谱-质谱条件优化

以C18柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）为分离柱，比较了甲醇、乙腈作为流动相以及添加甲酸、甲酸铵对目标物分离行为及响应的影响。结果表明，采用甲醇-2 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸）作为流动相，梯度洗脱时，化合物分离效果及峰形较好，灵敏度高。

所有目标物在ESI+模式下能获得较高丰度的[M+H]+准分子离子峰。在选定的质谱条件下进行子离子扫描，选取信号最强最稳定的子离子作为定量离子，以多反应监测模式优化各种质谱参数，使化合物的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。优化后的质谱参数见表1。

3.2 样品前处理条件的优化

3.2.1 提取溶液的选择 21种杀菌剂药物极性差异较大。乙腈具有极性大、穿透力强的特点，可减少脂溶性杂质的提出，广泛用于残留分析中待测物的提取。王菲等[12]建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定5种中药材中10种三唑类杀菌剂，在提取液中加酸有助于提高中药材中某些三唑类杀菌剂的回收率。本实验考察了乙腈和酸化乙腈（含1%甲酸或1%乙酸）为提取液时对目标物的提取效率。通过加标回收法，在空白猪肝中加入21种三唑类杀菌剂混合标准溶液，加标水平均为5 μg/kg，混匀静置24 h后，再加入20 mL提取溶液，3种溶液的提取效率。用含1%甲酸-乙腈（AF）提取，糠菌唑、氟环唑的回收率低于60%; 用乙腈或1%乙酸-乙腈（AA）提取，各目标物回收率范围为70.0%～93.0%和59.8%～87.3%。其中，乙腈的提取回收率较高，因此选择乙腈作为提取溶剂。

3.2.2 提取溶剂体积及提取次数的优化 针对提取溶剂用量及次数优化，首先考察了10、20和30 mL乙腈对目标化合物的单次提取效率。结果表明，30与20 mL的提取效率明显优于10 mL，而20与30 mL提取效率差异不明显。因此，用20 mL乙腈对样品进行提取。

其次， 比较了总体积为20 mL乙腈分1次、2次和3次提取的效果。通过对比21种杀菌剂在不同提取次数下的回收率，发现2次以上的提取效果明显优于单次，其中腈苯唑、氟硅唑、戊菌唑和苯醚甲环唑的回收率提高了19%～28%， 2次提取与3次提取的回收率无明显提高。因此，本研究采用10 mL乙腈提取样品并重复一次。

3.2.3 净化条件的优化 为降低基质效应，本实验先选择用正己烷进行液液分配除脂。在空白猪肝样品中添加浓度为5 μg/kg的21种三唑类杀菌剂混合标准溶液，用乙腈提取样品并浓缩至5 mL，加入5 mL正己烷，充分混匀后于8000 r/min离心3 min。取下层乙腈溶液在氮气流下吹至近干，用1 mL甲醇复溶残渣并分析。结果表明，腈苯唑、灭菌唑、三唑酮等10种目标物的回收率低于60%。可能因上述化合物在正己烷中溶解度较大，除脂过程中出现损失。这与胡艳云等[2]用丙酮-乙酸乙酯-正己烷混合提取果蔬中20种三唑类农药、颜鸿飞等[11]用丙酮-正己烷振荡提取水果中的烯唑醇残留所报道的结果相似。鉴于部分三唑类杀菌剂易溶于正己烷，因此考虑其它净化手段。

2017年，Hong等[25]用乙腈和水混合液萃取，PRiME HLB柱净化，液相色谱-质谱法测定猪肉、牛肉、鸡肉和羊肉中44种头孢菌素。王智等[26]建立了PRiME HLB 固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱快速检测牛肝中18种促生长剂类药物。其中PRiME HLB柱无需经过活化和平衡，提取液直接上柱，上柱后，提取液中少量的水可使填料中亲水基团空间结构发生变化，能有效吸附蛋白、脂肪、磷脂等基质干扰物，降低了样品分析的基质效应，过程简单、快速、高效。因此，本实验选取PRiME HLB柱进行直接通过式净化。样品经乙腈提取后，氮吹浓缩至4 mL后，用水定容至5 mL，混匀上柱后，在重力作用下，可收集4.5 mL流出液，与过柱前相比，净化后的提取液澄清度显著提升。

通过式过柱净化过程中，若不挤干柱体，约有0.5 mL溶液残留在柱填充物中。为考察柱体中待测物残留情况，比较了5 mL提取液上样后，不挤干（4.5 mL）和挤干后（5.0 mL）流出液中待测目标物的浓度。两者中待测物测定浓度接近，回收率无明显差异。但挤出柱中残余液会增加流出液中的杂质含量，例如，处理猪肝样品，与未挤干的流出液相比，完全挤干的流出液低温存放12 h后，会出现部分絮状物; 基质效应增强了10%～15%。后续实验采用上柱后在重力作用下收集流出液，再进行下一步操作。

3.2.4 待测物溶解液优化 实验结果表明， 增加待测物溶液中水含量可改善氟康唑峰形，当乙腈与水的体积比为4∶6时，峰形最佳。 同时， 糠菌唑、环唑醇、硅氟唑和苯醚甲环唑等峰形也较对称。因此，将柱净化后的提取液加水稀释，使待测液中乙腈与水体积比接近4∶6。

3.3 基质效应

动物性产品中富含大量蛋白、脂肪等，在残留测定过程中易产生基质效应。不同基质对目标物离子化程度的影响存在差异。本研究分别比较相同浓度下，三唑类杀菌劑在猪肉、猪肝、猪脂肪空白基质提取液和溶剂中响应值的比值，计算公式为ME（%）=B/A×100（A为标准溶液响应值; B为基质匹配标准溶液响应值），当基质效应ME值大于或者小于100%时， 认为具有基质增强或抑制作用[27]。应用优化后的方法，猪肉基质效应为84%～106%，猪脂肪的基质效应为83%～104%，猪肝对目标物离子化的影响较为显著，基质效应为75%～107%，同时对21种三唑类杀菌剂混合标准中间液制备基质标准工作曲线与同浓度梯度的溶液标准曲线也进行了比较，其斜率比值在0.6～1.3之间。为降低基质效应影响，用空白样品提取液配制基质匹配标准曲线进行定量分析。

3.4 方法的線性范围与检出限、定量限

在空白样品提取液中添加不同浓度的标准品（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L），采用本方法测定，以峰面积为纵坐标，对应质量浓度为横坐标进行线性拟合，绘制基质匹配标准曲线，21种三唑类杀菌剂在0.5～100 μg/L浓度范围内，线性关系良好，相关系数R2>0.99。在最低添加水平下，以3倍和10倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限和定量限，21种杀菌剂的检出限（LOD）为0.3～0.6 μg/kg，定量限（LOQ）为1.0～2.0 μg/kg。空白猪肉、猪肝、猪脂肪样品在2.0、5.0和10.0 μg/kg加标浓度下，杀菌剂的平均回收率为69.5%～109.5%，相对标准偏差为0.4%～10.8%（表2）。

3.5 实际样品分析

为评估本方法的适用性，利用本方法对羊肉、牛肉、鸡肉及肝脏、肾脏、脂肪基质进行了空白样品添加回收实验，添加浓度在2.0～10.0μg/kg之间，回收率为67.3%～110.5%，RSD为2.3%～12.4%， 准确度和精密度均满足日常监测的需求。

用本方法检测了20个市售的猪肉、鸡肉等畜禽样品，包括4个猪肉样品、4个猪肝样品、3个猪脂肪样品、4个鸡肉样品、3个鸡肝样品和2个牛肉样品。其中，1个鸡肉样品中检出苯醚甲环唑，浓度为1.2 μg/kg，未超过日本所规定苯醚甲环唑在动物源性食品中最大残留限量10 μg/kg[7]。

4 结 论

以猪肉、猪肝及其脂肪为研究对象，建立了21种三唑类杀菌剂的分析测定方法，样品经乙腈提取，浓缩后加少量水，采用PRiME HLB柱去杂、UPLC-MS/MS分析。方法前处理操作简便，灵敏度较高，有效减少了基质干扰，能够满足日本和CAC对该类杀菌剂的限量要求。同时，本方法也适用于畜禽产品中肝脏、脂肪和肌肉组织中三唑类杀菌剂的检测。

References

1 Reeves R，Thiruchelvam M， Richfield E K， Cory-Slechta， D.A. Pharmacol. Biochem. Behavior， 2003， 76（2）： 315-326

2 HU Yan-Yun， XU Hui-Qun， YAO Jian， L Ya-Ning， SONG Wei， LI Wen-Jing， HAN Fang， ZHENG Ping. Chinese J. Anal. Chem.，  2014，  42（2）： 227-232

胡艳云， 徐慧群， 姚 剑， 吕亚宁， 宋 伟， 李文静， 韩 芳， 郑 平. 分析化学， 2014，  42（2）： 227-232

3 LI Ji-Ge， WANG Yu-Fei， SHIJia-Wei， JIANG Li， YAO Xun-Ping， FANG Lan-Yun. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，  2013，  （6）： 1345-1349

李继革， 王玉飞， 施家威， 蒋 丽， 姚浔平， 方兰云.  中国卫生检验杂志，  2013， （6）： 1345-1349

4 ZHANG Wei-Guo， GAO Jin-Shan， CHEN Shan-Shan， LI Chong-Jiu. Chinese J. Anal. Chem.，  2005，  33（10）： 1442-1444

张伟国， 高金山， 陈姗姗， 李重九.  分析化学，  2005，  33（10）： 1442-1444

5 Li Y B， Dong F S， Liu X， Xu J， Li J， Kong Z， Chen X， Liang X， Zheng Y. J. Chromatogr. A，  2012，  1224： 51-60

6 SUN Rui-Juan， GUO Jing， SONG Qian-Qian， SONG Wen-Hua. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis，  2013，  46（1）： 83-87

孙瑞娟， 郭 晶， 宋千千， 宋文华.  南开大学学报（自然科学版），  2013，  46（1）： 83-87

7 Mistry of Health， Labour and Welfare. Positive List System for Agricultural Chemical Residues in Foods. （2006-5-29）[2018-10-22]. http：//www.ffcr.or.jp/zaidan/FFCRHOME.nsf/pages/MRLs-p

8 Codex Alimentarius Commission Pesticide Residues in Food and Feed.（2016-07-01）[2018-10-22] http：//www.fao.org/fao-who-codexalimentarius//standards/pestres/pesticide-detail/en/？p_id=202

9 GB2763-2016， National Food Safety Standard-Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People's Republic of China

食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量.   中华人民共和国国家标准. GB 2763-2016

10 HUANG Chao-Qun， DING Hui-Ying， ZHU Xiao-Yu， CHEN Ling-Ling， LI Bo， LOU Cheng-Jie. Journal of Instrumental Analysis，  2011，  30（6）： 656-660

黄超群， 丁慧瑛， 朱晓雨， 陈玲玲， 李 铂， 楼成杰.  分析测试学报，  2011，  30（6）： 656-660

11 YAN Hong-Fei， LI Yong-Jun， WANG Mei-Ling， DAI Hua， ZHANG Ying， HUANG Zhi-Qiang. Analysis and Testing Technology and Instruments，  2012，  18（4）： 204-207

颜鸿飞， 李拥军， 王美玲， 戴 华， 张 莹， 黄志强.  分析测试技术与仪器，  2012，  18（4）： 204-207

12 WANG Fei， LI Tong， MA Chen. Chinese Journal of Chromatography，  2013，  31（3）： 191-199

王 菲， 李 彤， 马 辰.  色谱，  2013，  31（3）： 191-199

13 GE Na， LIU Xiao-Mao， LI Xue-Min， HUANG Xue-Zhe， WU Yan-Ping， LI Jin， LIU Yong-Ming. Journal of Instrumental Analysis，  2011，  30（12）： 1351-1355

葛 娜， 刘晓茂， 李学民， 黄学者， 吴艳萍， 李 金， 刘永明.  分析测试学报，  2011，  30（12）： 1351-1355

14 WU Li， CHEN Ming-Xue， MU Ren-Xiang， YING Xing-Hua， CAO Zhao-Yun. Journal of Instrumental Analysis，  2009，  28（7）： 846-854

吴 俐， 陈铭学， 牟仁祥， 应兴华， 曹赵云.  分析测试学报，  2009，  28（7）： 846-854

15 LI Ji-Ge， WANG Yu-Fei， SHI Jia-Wei， JIANG Li， YAO Xun-Ping， FANG Lan-Yun. Chinese Journal of Chromatography，  2012，  30（3）： 262-266

李继革， 王玉飞， 施家威， 蒋 丽， 姚浔平， 方兰云. 色谱，  2012，  30（3）： 262-266

16 WANG Hong-Bin， ZHAO Tian-Tian， LI Gui-Zhen， TAN Wei， LI Bin， YANG Min. Environmental Pollution & Control， 2015，  37（4）： 42-46

王红斌， 赵田甜，李桂镇， 谭 伟， 李 彬， 杨 敏.  环境污染与防治，  2015，  37（4）： 42-46

17 LIU Bo， YIN Hang， GAO Wen-Hui. Journal of Hebei University of Science and Technology，  2013，  34（5）： 417-421

劉 博， 尹航， 高文惠.  河北科技大学学报，  2013，  34（5）： 417-421

18 GUO Ya-Yun， DING Yan， HAN Xiao-Mei， WANG Zhe， SHI Hong-Mei. Journal of Analytical Science， 2018， 34（3）： 409-412

郭亚芸， 丁 燕， 韩晓梅， 王 哲， 史红梅. 分析科学学报， 2018， 34（3）： 409-412

19 Pastor-Belda M， Garrido I， Campillo N， Vias P，Hellín P， Flores P. Food Chem.，  2017，  233： 69-76

20 GB23200.49-2016， National Food Safety Standards-Determination of Difenoconazole Residue in FOODS Gas Chromatography-Mass Spectrometry. National Standards of the Peoples Republic of China

食品安全国家标准-食品中苯醚甲环唑残留量的测定气相色谱-质谱法.  中华人民共和国国家标准. GB 23200.49-2016