基于微流控技术的纳升级蛋白质结晶筛选方法的研究进展

高洁 方群

摘 要 X射线晶体学技术是目前蛋白质结构测定中最主要的方法。为了得到满足衍射要求的高質量蛋白质晶体，研究者通常耗费大量试剂和样品进行大规模结晶条件筛选。微流控技术通过对超微量流体的操纵，可大幅降低在蛋白质结晶筛选中蛋白样品的消耗。本文依据结晶方法，分别介绍了基于微批量法、蒸气扩散法、自由界面扩散法和透析法的微流控蛋白质结晶筛选方法的研究进展。

关键词 微流控技术; 蛋白质结晶筛选; 纳升级; 评述

1 引 言

蛋白质作为一种生物大分子，其结构的测定对生命科学的发展具有重要意义。生物系统内的作用机制和进化过程都与蛋白质结构息息相关。蛋白质结构的测定有助于从原子层面理解生命活动，从而为疾病诊断和新药设计提供新的基础[1]。目前，蛋白质结构主要通过3种方法测定：X射线晶体学技术（X-ray crystallography）、核磁共振波谱技术（Nuclear magnetic resonance， NMR）和电子显微镜技术（Electron microscopy）。NMR技术可测定的蛋白质种类受限较大，要求测定对象须是中小分子量的可溶性蛋白，而且浓度为1 mmol/L时不聚集。电子显微镜借助电子衍射技术和单颗粒技术解析蛋白质结构，但电子衍射技术需蛋白质的二维晶体，而单颗粒技术解析蛋白质结构的分辨率不佳。近年来，冷冻电镜技术（Cyro-electron microscopy， cryo-EM）的快速发展基本解决了借助单颗粒技术解析结构的分辨率问题，显著提高了电镜技术在蛋白质结构测定中的地位[2，3]。然而，X射线晶体学技术仍然是当前蛋白质结构测定中最主要的方法。该技术对蛋白质的分子量和可溶性没有特殊要求，解析结构的分辨率能达到单个原子水平。同时，同步辐射光源、微量和自动化液体操作等相关技术的发展都在持续有力地推动该技术的进一步发展[4]。

目前，结构已被测定的蛋白质仍只占蛋白质总数的很小部分，据估计，每百个研究的蛋白质中，仅约两个蛋白质的结构能被成功测定[5]。利用X射线晶体学技术进行蛋白质结构测定的主要瓶颈之一是难以获得满足衍射分析要求的蛋白质晶体。蛋白质结晶过程受到蛋白质纯度和浓度、沉淀剂种类和浓度、pH值、添加剂、离子强度、温度等众多因素的影响[6]，上述因素的细微变化都可能产生不利于晶体衍射的晶体性质变化，如晶体尺寸小、形貌差、溶剂含量高、机械强度差等[4]。因此，高质量的蛋白质结晶需要依靠对成百上千个蛋白质结晶反应的筛选实验实现，而很多珍稀蛋白质的样品本身的制备量通常不足毫克[7]，这对筛选过程的微量化、规模化和自动化提出了很高的要求。

微流控技术是操纵微量流体的技术。将微流控技术用于蛋白质结晶筛选，具有以下优势：（1）显著降低蛋白样品和沉淀剂的消耗，节约实验成本，这一特点对难以表达和提纯的珍稀蛋白质的意义尤为重要; （2）实现常规毫升和微升体积下无法完成的操作，如对分子扩散和晶体成核的精确控制[6]; （3）借助微体系下的自由对流环境，得到高质量晶体[8]; （4）自动化程度高，耗时少，筛选通量高。本世纪以来，微流控技术已成为蛋白质结晶筛选的有力工具，近年来，研究者分别从微流控蛋白质结晶方法[4，6，9～11]、微流控结晶装置[12]和蛋白质结晶技术发展趋势[13]等方面对相关领域的研究进展进行了综述。本文依据结晶方法，对基于微流控技术的超微量纳升级蛋白质结晶筛选方法进行了评述。

2 纳升级蛋白质结晶筛选方法

蛋白质结晶反应是蛋白质在溶液中的相转变[14]，当溶液中的蛋白质和沉淀剂浓度达到相图中的过饱和区域时，蛋白质分子开始成核，从溶液中析出，蛋白质浓度减小。整个体系由成核区域（Nucleation zone）向亚稳区域（Metastable zone）转变，此时成核不再发生，晶体开始生长，最终达到溶解度曲线（Solubility curve）。微批量法（Microbatch）、蒸气扩散法（Vapour diffusion）、透析法（Dialysis）和自由界面扩散法（Free interface diffusion， FID）是常见的蛋白质结晶方法，基于这4种方法的体系在晶体成核前的路径是不同的，但成核开始后，路径统一[6]， 表1比较了4种结晶方法的优点与不足。由于微批量法的实验装置结构简单，早期基于微流控技术的纳升级蛋白质结晶筛选多选用微批量法为结晶方法。在此基础上，研究者逐步实现了基于其它结晶方法的结晶实验。

2.1 基于微批量法的纳升级蛋白质结晶筛选系统

基于微批量法的蛋白质结晶反应是指蛋白质溶液和沉淀剂溶液以特定浓度混合，形成蛋白质结晶反应器，在蛋白质分子成核前，反应器内各组分的浓度均保持不变[14]。微批量法由Chayen等[15]于1990年首次提出，为防止微量样品和试剂蒸发，大部分基于微批量法的结晶实验在油下进行，故亦称为油下微批量法（Microbatch under oil）[16]。该方法的优点主要有：蛋白质和沉淀剂浓度可准确控制，有利于对整个蛋白质结晶过程进行研究，如相图的绘制; 油下加样与反应受水相蒸发的影响很小，有利于实现筛选的微量化和规模化; 蛋白质结晶筛选可在不同温度下进行，以获得更多结晶条件[17]; 通过改变油的种类和配比，可以实现油下的蒸气扩散法[18]，将两种结晶方法的优势有效地结合起来。微批量法的局限性主要在于成核前的蛋白质和沉淀剂浓度在反应器中保持不变，无法实现对浓度的筛选，沉淀剂中无法使用溶于油或与油反应的有机试剂，蛋白质初始浓度过高，容易产生碎晶和沉淀。

2.1.1 连续流液滴技术 Ismagilov研究组[19]利用T型通道连续流液滴技术[20]，发展了一种有效调节纳升级液滴组成的蛋白质结晶筛选芯片。通过改变汇流通道内不同试剂的流速形成不同试剂配比的液滴，进行基于微批量法的蛋白质结晶筛选。该芯片每秒生成数个蛋白质和沉淀剂含量不同的液滴，每个液滴的蛋白样品消耗为4 nL甚至更少，实现了高通量和低消耗筛选蛋白质结晶。基于该方法，Gerdts等[21]使用名为Microcapillary Protein Crystallization System（MPCS）[22]的结晶系统，通过浓度梯度的筛选，用微批量法对29种蛋白质的基于常规蒸气扩散法的结晶实验进行重复，成功结晶了其中28种蛋白质。 此外，Pham等[23]将该方法和小角X射线散射（Small-angle X-ray scattering， SAXS）技术结合，生成的液滴流经X射线束，记录SAXS数据，用于研究溶液中的蛋白质结晶过程，显著降低了样品和时间消耗。为了将连续流液滴技术应用于基于蒸气扩散法的蛋白质结晶实验，Ismagilov研究组[24]采用双汇流通道，交替间隔形成结晶液滴和高浓度盐液滴。相邻的液滴组成基于蒸气扩散法的蛋白质结晶反应器。通过调节试剂流速即可改变液滴间距，并以此调节蒸气扩散速率，有助于获得理想的结晶结果。

本研究组发展了一种可进行快速进样和试样更换的连续流液滴筛选系统[25]。该系统中，不同的沉淀剂储于缺口管阵列中，蛋白样品和缓冲液储于芯片上的储液池中，三者汇合后，通过十字通道生成液滴，形成基于微批量法的蛋白质结晶反应器。该系统的优势在于通过移动缺口管阵列，芯片上的取样探针可划过不同的缺口管吸入不同的沉淀剂，从而使连续流液滴技术能够用于不同沉淀剂的筛选实验，且单种沉淀剂蛋白样品消耗仅为2.4 nL。

2.1.2 液滴储存器技术 为了筛选不同的沉淀剂，Ismagilov研究组发展了一种液滴储存器（Droplet cartridge）技术[26]，用于蛋白质结晶筛选。其方法是将沉淀剂液滴预先引入毛细管中储存，再通过漏斗型接口将毛细管和芯片的T型通道连接，分别通入蛋白质溶液和沉淀剂液滴，两者融合生成结晶反应器液滴，流入下游的的毛细管中，进行基于微批量法的蛋白质结晶反应。液滴储存器易操作且低消耗[27]，筛选48个条件所消耗的蛋白样品少于1 μL。

2.1.3 液滴组装技术 本研究组[28]基于液滴组装技术，发展了一种自动化的微流控液滴筛选平台——液滴实验室（DropLab），并将其应用于蛋白质结晶筛选。该系统利用拉尖的毛細管依次吸取蛋白质溶液、沉淀剂和油相，直接组装生成结晶反应器液滴，进行基于微批量法的蛋白质结晶反应，筛选50个不同的沉淀剂共消耗蛋白样品300 nL。

2.1.4 滑动芯片技术 Ismagilov研究组[29]在基于基片的预装载技术[30]的基础上，发展了一种滑动芯片（Slipchip）技术，用于蛋白质结晶筛选。实验时先将预先生成的沉淀剂液滴加入下层基片的微孔中，再滑动上层基片，使上层基片的微孔和下层基片的微槽连成一条完整的通道，然后从通道一端通入蛋白样品，使上层基片的微孔中充满样品，最后再滑动上层基片，使上下两层基片的微孔对准，沉淀剂和蛋白样品混合，形成基于微批量法的蛋白质结晶反应器。该方法的优点在于芯片结构简单，无须键合，且操作过程不用借助泵和阀，受实验条件限制小。每个反应仅消耗蛋白样品5 nL，单块芯片可同时完成48个结晶反应筛选。该研究组[31]将滑动芯片进一步改进，简化了沉淀剂装载的方法，实现了蛋白质和沉淀剂不同混合比例的筛选。他们还通过改变芯片结构在滑动芯片上实现了基于自由界面扩散法的蛋白质结晶筛选[32]。上层基片上加工的微槽，在装载试剂和样品时用于连接微孔，在反应发生时作为自由界面扩散的通道，下层基片上加工有装载沉淀剂和蛋白样品的微孔。通过改变通道尺寸及对应微孔之间的距离，获得不同的扩散平衡时间，增加了筛选条件的多样性。

2.1.5 离心芯片技术 Li等[33]利用毛细作用和离心力驱动技术发展了一种用于纳升级蛋白质结晶筛选的微流控离心芯片。先将沉淀剂和蛋白质溶液加入相应的芯片通道入口，溶液在毛细作用下流入并充满对应的通道，由于毛细截止阀的作用，溶液无法流入反应腔室内。然后，在大于6000 r/min的转速下将芯片离心1 min，通道中的沉淀剂和蛋白质溶液在离心力驱动下，进入反应腔室并混合。最后，加油密封，形成基于微批量法的蛋白质结晶反应器。每个结晶反应消耗试剂31 nL，单块芯片可同时完成24个反应。为了在离心芯片上实现基于蒸气扩散法的蛋白质结晶筛选，该研究组[34]对该芯片进行改进，增加了沉淀剂储存通道和蒸气扩散腔室。蒸气扩散腔室和反应腔室、沉淀剂储存通道以细通道相连接，形成二级毛细截止阀。6000 r/min的转速只能使通道中的溶液冲破一级毛细截止阀，而无法通过二级毛细截止阀，在扩散腔室保留气体空间以进行蒸气扩散。采用该芯片筛选得到的结晶条件多于传统悬滴法。

2.1.6 浓度梯度技术 Yang等[35]将其研制的浓度梯度芯片[36，37]进行改进，用于纳升级蛋白质结晶筛选。该芯片包含浓度梯度形成通道、油相通道和液滴生成通道。浓度梯度形成原理为，两种溶液在弧形通道汇合，以1：1的比例流入直型通道，混合后的溶液在下一级的弧形通道重复以上过程，每种溶液在流经一级弧形和直型轨道后，产生3种不同浓度的溶液[36]。在蛋白质结晶筛选实验中，沉淀剂、蛋白样品或两者的混合溶液从水相入口通入，经过浓度梯度形成区域形成不同配比的结晶反应溶液，然后借助T型通道生成液滴，形成基于微批量法的结晶反应器。通过调节油相的流速可改变生成液滴的体积，最小可达到0.57 nL，在单块芯片上，可同时完成5种沉淀剂各8个不同浓度的筛选。

Abdallah等[38]利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）材料加工了一个微流控浓度梯度装置，用于蛋白质结晶筛选。该装置分为流体层、薄膜和控制层，薄膜呈自然状态时，阀门呈关闭状态。先将负压施加于控制层，薄膜向下弯曲，阀门打开。再将正压施加于流体层，推动两个入口的纯水和沉淀剂进入通道，清洗装置。然后将清水更换为蛋白样品，使沉淀剂和蛋白样品在每个微孔中以不同的比例混合。最后向控制层加正压，阀门关闭，形成基于微批量法的结晶反应器。每个反应器仅消耗蛋白样品25 nL，共形成170个不同浓度的结晶反应器。

2.1.7 顺序操作液滴阵列技术 本研究组[39]将顺序操作液滴阵列（Sequential operation droplet array， SODA）技术[40]应用于纳升级蛋白质结晶筛选。实验中，先将毛细管、玻璃芯片和储液池固定在液滴机器人的特定位置，利用自动平移台按计算机程序操纵毛细管逐个从多孔板储液池中吸取沉淀剂，注入芯片上的微孔内形成沉淀剂液滴，待生成由不同的沉淀剂液滴构成的液滴阵列后，再操纵毛细管吸取蛋白样品溶液，并依次将定体积蛋白质溶液加入每个沉淀剂液滴内。蛋白质加入操作采用半接触点样方式进行，避免产生不同沉淀剂之间的交叉污染。上述操作均在油的覆盖下完成，蛋白样品与沉淀剂液滴混合形成基于微批量法的结晶器。借助SODA技术生成的液滴体积仅为4～8 nL，每种蛋白样品筛选的结晶条件最多达到96个，且有向更大筛选规模拓展的潜力。

2.2 基于蒸气扩散法的纳升级蛋白质结晶筛选系统

蒸气扩散法是目前常规蛋白质结晶筛选中使用最广泛的方法[14]。基于蒸气扩散法的蛋白质结晶反应器通常由两部分组成，较低浓度的蛋白质与沉淀剂混合溶液反应器和高浓度沉淀剂储液池。由于反应器中的水分经由扩散途径向储液池扩散，处于不饱和区域的蛋白质和沉淀剂浓度逐渐升高，进入过饱和区域，蛋白质分子开始成核。蒸气扩散发生的过程，本身就自动完成了对蛋白质和沉淀剂浓度的筛选。该方法的优点主要有：通过对浓度的筛选提高筛选成功率; 通过调节储液池中溶液的浓度，可灵活控制反应器中的各个成分及浓度; 通过改变反应器和储液池之间的距离，可调节扩散速率。蒸气扩散法的局限性主要在于体系较为复杂，且其蒸气扩散是动态过程，一旦实验开始，条件难以精确定量控制。同时，挥发性试剂和温度的变化对结晶反应影响较大，可能会造成晶体溶解。

2.2.1 超声液滴喷射技术 超声液滴喷射技术是一种微量液滴操纵技术，通过超声发生器将超声能量聚焦于液气界面上，喷射出微量液滴。由于其完全非接触式的液滴操纵方式，可有效解决不同样品/试剂之间的交叉污染和样品吸附问题。将该技术用于蛋白结晶筛选，在提升晶体质量[41]和提高筛选通量[42]方面具有优势。Teplitsky等[43]利用Labcyte公司的Echo 550超声液滴操纵仪器，进行了蛋白质之间或与小分子和配体的共结晶实验。实验中，由超声液滴操纵仪器向孔板内喷射2.5 nL蛋白样品、2.5 nL沉淀剂和2.5 nL小分子溶液，组成一个混合液滴。孔板的储液池中存有母液，孔板盖能够防止液滴向外界蒸发，因此每个液滴在孔板中形成基于蒸气扩散法的蛋白质结晶反应器。每个孔可容纳18个液滴， 在一个96孔板中能同时进行1728个结晶反应。

2.2.2 3D打印芯片技术 本研究组[44]将3D打印技术应用到液滴阵列芯片的加工中，结合SODA技术，发展了一种基于蒸气扩散法的纳升级蛋白质结晶筛选方法系统。利用3D打印技术可在加工出具有高深宽比，且深度不同的微孔结构。3D打印芯片的表面有一层聚对二甲苯（Parylene）涂层，借助该涂层和熔融石蜡填充，可封闭3D打印材料内的微孔隙，保证芯片的密封性和稳定性。实验中，借助液滴操纵机器人在毛细管中吸入沉淀剂和蛋白样品，注入加油的结晶液滴孔中生成结晶液滴，再向沉淀剂孔中加入高浓沉淀剂，最后密封形成基于蒸气扩散法的结晶反应器。每个反应器仅消耗蛋白样品10 nL，每块芯片中可完成84个结晶反应，且能通过控制油层厚度调节蒸气扩散速度。

2.3 基于透析法的纳升级蛋白质结晶筛选系统

透析法是基于透析膜的一种蛋白质结晶方法，利用透析膜将蛋白质和沉淀剂分隔，蛋白质因分子量较大无法通过透析膜，而小分子沉淀剂可以透过[6]。在基于透析法的结晶实验中，蛋白质一侧的蛋白浓度始终保持不变，而沉淀剂由另一侧通过透析膜扩散进入蛋白质一侧，在结晶过程中，其浓度逐渐升高，直至使结晶反应进入成核区域。此外，还有一类透气膜也被用于类似透析法的蛋白质结晶筛选中，只有水和小分子量有机溶剂的蒸气能够通过该透气膜，而盐、高分子和蛋白质都无法通过，这使得溶液中所有成分的浓度可快速、精确地可逆转变[45]。相较于其它几种蛋白质结晶方法，透析法能可逆地调节结晶反應器内的浓度，将晶体成核和生长过程分开，独立地进行浓度优化。因此，基于透析法的蛋白质结晶筛选系统的最大的优点在于能够得到高质量的大晶体，而其不足是体系较复杂，且实现高通量筛选难度较大。

Shim等[45]结合透析法和晶种法的优势发展了一种相芯片（Phase chip），该芯片以一层15 μm厚的PDMS为透气膜。实验中，先将1 nL蛋白质结晶液滴引入装置中，液滴会在表面张力的驱动下有序地进入每个微孔中。在储液池中通入空气或高浓度的盐溶液，液滴中的水分通过PDMS膜向储液池扩散，液滴中各组分的浓度升高，进入过饱和区域，蛋白质分子成核，出现大量小晶体。然后，在储液池中通入纯水，纯水向结晶液滴扩散，各组分的浓度变低，小晶体（晶种）溶解到溶液中，这一现象有利于大晶体的生长，从而获得大尺寸、高质量的晶体。

2.4 基于自由界面扩散法的纳升级蛋白质结晶筛选系统

自由界面扩散法又称液-液扩散法，是指两种溶液通过微通道相连，溶液中的组分通过两溶液界面进行自由扩散。在基于自由界面扩散法的蛋白质结晶反应中，对于蛋白质溶液一侧，反应初始时，蛋白质浓度最高，而沉淀剂浓度为0。随着扩散的进行，蛋白质浓度逐渐降低，同时沉淀剂浓度逐渐升高，进入过饱和区域，蛋白质分子开始成核。自由界面扩散法的优点是成核概率高，且晶体质量好。但该方法样品消耗量较大，且存在重力的混杂效应，在蛋白质结晶领域并不常用[46]。引入微流控技术后，上述两个问题均被解决，自由界面扩散法在该领域得到了一定应用。

Quake研究组[47]利用PDMS微泵微阀技术[48]发展了一种基于自由界面扩散法的蛋白质结晶芯片。通过控制微阀使沉淀剂和蛋白质溶液分别进入各自的反应微孔，再打开连接两微孔通道上的微阀，使两种溶液形成扩散界面，进行基于自由界面扩散法的蛋白质结晶反应。该芯片在单个反应平均消耗12.5 nL蛋白质溶液的条件下，相较传统方法出晶概率更高、出晶速度更快、晶体质量更好。Maeki等[49]对该方法进行改进，将两侧微孔中的溶液改为结晶溶液和晶种溶液，将自由界面扩散法和微晶种法结合，从而控制蛋白质结晶过程，用于研究有限空间内蛋白质晶体的生长行为。Quake研究组[50]还将基于自由界面扩散法和蒸气扩散法的蛋白质结晶实验集成在一块芯片上进行。蒸气扩散通过反应微孔和储液池之间的一层透气PDMS薄膜实现。该芯片通过渗透浴强度调节蒸气扩散速率，通过通道长度控制自由界面扩散速率，从而实现蛋白质结晶条件的动态优化。

基于PDMS微泵微阀技术，Quake研究组[51]还发展了一种配比芯片（Formulator chip），该芯片由液体量取和液体混合两个结构单元组成，能在5 nL的反应器中快速混合蛋白样品和沉淀剂，用于系统地研究蛋白质相行为。Hansen研究组[52]在配比芯片的基础上，结合液滴技术，发展了一个集成试剂混合、液滴生成和晶体孵育的微流控蛋白质结晶筛选平台。实验芯片中，沉淀剂和蛋白样品在5 nL的圆环中混合后，借助油相生成纳升级液滴，形成基于微批量法的蛋白质结晶反应器。

该平台的优点为在每个反应的样品消耗低于5 nL的情况下集成实现了蛋白质相图研究和结晶筛选实验。

2.5 其它纳升级蛋白质结晶筛选方法

Feuerborn等[53]利用水相在油水间隔流中的水平对流在反应溶液中形成浓度梯度，用于进行蛋白质结晶筛选。实验中，先在充满油相FC-40的Teflon管中通入少量空气，再通入60 nL蛋白样品，然后间隔通入油和20 nL沉淀剂，形成5个沉淀剂液滴。当管内液体开始流动时，由于不同物质在FC-40中的界面张力不同，水相液滴的移动速度>油相液滴速度>气泡速度，使水相液滴包裹住油相液滴，形成一个大液滴，并产生水平对流。大液滴中油相间隔的半开放反应腔室与蛋白样品向后方的对流形成了浓度梯度，晶体在合适的浓度孵育生成。

3 总结与展望

近十几年来，基于微流控技术的纳升级蛋白质结晶筛选方法得到了飞速发展。利用微流控技术，常规体系下的基于微批量法、蒸气扩散法、透析法和自由界面扩散法的蛋白质结晶反应都能在微体积下实现。此外，微流控蛋白质结晶芯片材料的发展，显著地推动了原位衍射技术[54]在蛋白质结晶筛选领域的发展。芯片材质由玻璃[55]和PDMS[50]，发展到聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）[22]、聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl methacrylate， PMMA）[56]、环烯烃共聚物（Cyclic olefin copolymer， COC）[57，58]和聚酯薄膜（Mylar）[59，60]等材料，使得通过微量的蛋白质结晶反应即有可能获得用于结构解析的全套衍射数据。

尽管基于微流控技术的纳升级蛋白质结晶筛选系统具有低消耗、集成化、自动化、对结晶反应的操控性强、利于成核和晶体生长、可用于原位衍射等优点，但目前文献报道的大部分系统的应用还停留于模型蛋白的结晶筛选水平，尚未应用于实际蛋白样品的筛选。这可能主要是由两个原因造成的： （1）多数纳升级蛋白质结晶筛选系统的筛选规模不大，筛选沉淀剂的种类尚未达到实际蛋白样品结晶条件初筛的要求; （2）相较于商业化蛋白质结晶筛选仪器[61]，微流控系统在通量、操作难度和自动化程度等方面，尚存在一定劣势。相信随着微流控技术的进一步发展，微流控蛋白质结晶筛选系统能够解决上述问题，从而应用于实际蛋白样品的筛选， 为蛋白质结构测定提供强有力的工具。

References

1 Mcpherson A. Methods， 2004， 34（3）： 254-265

2 Liao M， Cao E， Julius D， Cheng Y. Nature， 2013， 504（7478）： 107

3 Merk A， Bartesaghi A， Banerjee S， Falconieri V， Rao P， Davis M I， Pragani R， Boxer M B， Earl L A， Milne J L S， Subramaniam S. Cell， 2016， 165（7）： 1698-1707

4 Gorrec F. Drug Discovery Today， 2014， 19（10）： 1505-1507

5 Khurshid S， Saridakis E， Govada L， Chayen N E. Nat. Protoc.， 2014， 9（7）： 1621-1633

6 Li L， Ismagilov R F. Annu. Rev. Biophys.， 2010， 39（39）： 139-158

7 Newby Z E R， O'Connell J D I， Gruswitz F， Hays F A， Harries W E C， Harwood I M， Ho J D， Lee J K， Savage D F， Miercke L J W， Stroud R M. Nat. Protoc.， 2009， 4（5）： 619-637

8 Sauter C， Dhouib K， Lorber B. Cryst. Growth Des.， 2007， 7（11）： 2247-2250

9 Leng J， Salmon J. Lab Chip， 2009， 9（1）： 24-34

10 ZHU Li-Na， ZHU Ying， FANG Qun. Chem. J. Chinese U.， 2014， 35（1）： 1-11

朱麗娜， 祝 莹， 方 群. 高等学校化学学报， 2014， 35（1）： 1-11

11 Juarez-Martinez G. Encyclopedia of Nanotechnology. Dordrecht， the Netherlands： Springer-Verlag Press， 2016： 1235-1248

12 Shi H， Xiao Y， Ferguson S， Huang X， Wang N， Hao H. Lab Chip， 2017， 17（13）： 2167-2185

13 Gavira J A. Arch. Biochem. Biophys.， 2016， 602（SI）： 3-11

14 Chayen N E. Acta Crystallogr. D， 1998， 54（1）： 8-15

15 Chayen N E， Shaw Stewart P D， Maeder D L， Blow D M. J. Appl. Cryst.， 1990， 23（4）： 297-302

16 Chayen N E， Shaw Stewart P D. J. Cryst. Growth， 1992， 122（1-4）： 176-180

17 D'Arcy A， Mac Sweeney A， Stihle M， Haber A. Acta Crystallogr. D， 2003， 59（2）： 396-399

18 D'Arcy A， Elmore C， Stihle M， Johnston J E. J. Cryst. Growth， 1996， 168（1-4）： 175-180

19 Zheng B， Roach L S， Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（37）： 11170-11171

20 Thorsen T， Roberts R W， Arnold F H， Quake S R. Phys. Rev. Lett.， 2001， 86（18）： 4163-4166

21 Gerdts C J， Stahl G L， Napuli A， Staker B， Abendroth J， Edwards T E， Myler P， Van Voorhis W， Nollert P， Stewart L J. J. Appl. Crystallogr.， 2010， 43（5）： 1078-1083

22 Gerdts C J， Elliott M， Lovell S， Mixon M B， Napuli A J， Staker B L， Nollert P， Stewart L. Acta Crystallogr. D， 2008， 64（11）： 1116-1122

23 Pham N， Radajewski D， Round A， Brennich M， Pernot P， Biscans B， Bonnete F. Anal. Chem.， 2017， 89（4）： 2282-2287

24 Zheng B， Tice J D， Roach L S， Ismagilov R F. Angew. Chem. Int. Edit.， 2004， 43（19）： 2508-2511

25 Sun M， Fang Q. Lab Chip， 2010， 10（21）： 2864-2868

26 Zheng B， Ismagilov R F. Angew. Chem. Int. Edit.， 2005， 44（17）： 2520-2523

27 Chen D L， Ismagilov R F. Curr. Opin. Chem. Biol.， 2006， 10（3）： 226-231

28 Du W， Sun M， Gu S， Zhu Y， Fang Q. Anal. Chem.， 2010， 82（23）： 9941-9947

29 Du W， Li L， Nichols K P， Ismagilov R F. Lab Chip， 2009， 9（16）： 2286-2292

30 Zhou X， Lau L， Lam W W L， Au S W N， Zheng B. Anal. Chem.， 2007， 79（13）： 4924-4930

31 Li L， Du W， Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc.， 2010， 132（1）： 106-111

32 Li L， Du W， Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc.， 2010， 132（1）： 112-119

33 Li G， Chen Q， Li J， Hu X， Zhao J. Anal. Chem.， 2010， 82（11）： 4362-4369

34 Wang L， Sun K， Hu X， Li G， Jin Q， Zhao J. Sens. Actuators B， 2015， 219： 105-111

35 Yang C， Liu Y， Di Y， Xu Z. Microfluid. Nanofluid， 2015， 18（3）： 493-501

36 Yang C， Wu Y， Xu Z， Wang J. Lab Chip， 2011， 11（19）： 3305-3312

37 Yang C， Xu Z， Lee A P， Wang J. Lab Chip， 2013， 13（14）： 2815-2820

38 Abdallah B G， Roy-Chowdhury S， Fromme R， Fromme P， Ros A. Cryst. Growth Des.， 2016， 16（4）： 2074-2082

39 Zhu Y， Zhu L， Guo R， Cui H， Ye S， Fang Q. Sci. Rep.， 2014， 4： 5046

40 Zhu Y， Zhang Y， Cai L， Fang Q. Anal. Chem.， 2013， 85（14）： 6723-6731

41 Villasenor A G， Wong A， Shao A， Garg A， Kuglstatter A， Harris S F. Acta Crystallogr. D， 2010， 66（5）： 568-576

42 Yin X， Scalia A， Leroy L， Cuttitta C M， Polizzo G M， Ericson D L， Roessler C G， Campos O， Ma M Y， Agarwal R， Jackimowicz R， Allaire M， Orville A M， Sweet R M， Soares A S. Acta Crystallogr. D， 2014， 70（5）： 1177-1189

43 Teplitsky E， Joshi K， Ericson D L， Scalia A， Mullen J D， Sweet R M，Soares A S. J. Struct. Biol.， 2015， 191（1）： 49-58

44 Liang Y， Zhu L， Gao J， Zhao H， Zhu Y， Ye S， Fang Q. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2017， 9（13）： 11837-11845

45 Shim J， Cristobal G， Link D R， Thorsen T， Fraden S. Cryst. Growth Des.， 2007， 7（11）： 2192-2194

46 Mcpherson A. Crystallization of Biological Macromolecules， Plainview， USA： Cold Spring Harbor Lab. Press， 1999

47 Hansen C L， Skordalakes E， Berger J M， Quake S R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2002， 99（26）： 16531-16536

48 Unger M A， Chou H P， Thorsen T， Scherer A， Quake S R. Science， 2000， 288（5463）： 113-116

49 Maeki M， Yamazaki S， Pawate A S， Ishida A， Tani H， Yamashita K， Sugishima M， Watanabe K， Tokeshi M， Kenis P J A， Miyazaki M. CrystEngComm， 2016， 18（40）： 7722-7727

50 Hansen C L， Classen S， Berger J M， Quake S R. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（10）： 3142-3143

51 Hansen C L， Sommer M， Quake S R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2004， 101（40）： 14431-14436

52 Lau B T C， Baitz C A， Dong X P， Hansen C L. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（3）： 454-455

53 Feuerborn A， Prastowo A， Cook P R， Walsh E. Lab Chip， 2015， 15（18）： 3766-3775

54 Aller P， Sanchez-Weatherby J， Foadi J， Winter G， Lobley C M C， Axford D， Ashton A W， Bellini D， Brandao-Neto J， Culurgioni S， Douangamath A， Duman R， Evans G， Fisher S， Flaig R， Hall D R， Lukacik P， Mazzorana M， McAuley K E， Mykhaylyk V， Owen R L， Paterson N G， Romano P， Sandy J， Sorensen T， Von Delft F， Wagner A， Warren A， Williams M， Stuart D I， Walsh M A. Methods Mol. Biol.， 2015， 1261： 233-253

55 Yadav M K， Gerdts C J， Sanishvili R， Smith W W， Roach L S， Ismagilov R F， Kuhn P， Stevens R C. J. Appl. Crystallogr.， 2005， 38（6）： 900-905

56 Lyubimov A Y， Murray T D， Koehl A， Araci I E， Uervirojnangkoorn M， Zeldin O B， Cohen A E， Soltis S M， Baxter E L， Brewster A S， Sauter N K， Brunger A T， Berger J M. Acta Crystallogr. D， 2015， 71（4）： 928-940

57 Ng J D， Clark P J， Stevens R C， Kuhn P. Acta Crystallogr. D， 2008， 64（2）： 189-197

58 Pinker F， Brun M， Morin P， Deman A， Chateaux J， Olieric V， Stirnimann C， Lorber B， Terrier N， Ferrigno R， Sauter C. Cryst. Growth Des.， 2013， 13（8）： 3333-3340

59 Broecker J， Klingel V， Ou W， Balo A R， Kissick D J， Ogata C M， Kuo A， Ernst O P. Cryst. Growth Des.， 2016， 16（11）： 6318-6326

60 Broecker J， Morizumi T， Ou W， Klingel V， Kuo A， Kissick D J， Ishchenko A， Lee M， Xu S， Makarov O， Cherezov V， Ogata C M， Ernst O P. Nat. Protoc.， 2018， 13（2）： 260-291

61 LIANG Yi-Ran， ZHU Ying， FANG Qun. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（12）： 1137-1144

梁翼然， 祝 瑩， 方 群. 色谱， 2016， 34（12）： 1137-1144