肠道菌群对肿瘤影响的研究进展△

樊逸夫，白晓敏，杜娟#

1解放军海军军医大学中医系，上海 200433

2陆军第九五二医院妇产科，青海 816000

人类的肠道内存在着大量、种类众多的微生物群落，包括细菌、真菌、古生菌以及病毒。一个健康成人肠道内的微生物总质量可达1～1.5 kg，包含的细菌数量则可达1×1014个，是人类细胞总数的10倍以上[1-4]。肠道内如此庞大的微生物群落构成了一个极为复杂的集体，即肠道菌群[5]。肠道菌群与宿主的共存，形成了人体极为重要的微生态系统，更有学者称其为重要的代谢“器官”[6-7]。肠道菌群在与宿主共生与进化的过程中，参与许多非常重要的生理活动，包括：①合成人体所需的维生素、氨基酸；②促进代谢转化和有益的饮食成分的吸收；③与肠道免疫系统相互影响并促进机体的免疫功能；④转化或排泄有毒物质；⑤抵御外来细菌的侵袭等[8-9]。肠道菌群的失调与人体的健康密切相关[10]，近年来，肠道菌群在肿瘤的发生机制及治疗作用方面的研究是备受关注的热点。本文就近几年肠道菌群对肿瘤影响的研究进展归纳总结如下。

1 胆汁酸与肠道厌氧菌

肝脏以胆固醇为原料合成初级胆汁酸，与甘氨酸或牛磺酸共轭，并经过肠肝循环。虽然经肝脏、胆囊与肠道系统的肠肝循环达到了约95%的有效率，但仍有5%的胆汁酸会脱离肠肝循环，经肠道厌氧菌如类杆菌属7α-羟化酶转化为脱氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）、石胆酸等次级胆汁酸[3,11]。次级胆汁酸已被证实与胆结石、结肠癌、肝癌的形成有关，结肠癌患者体内的DCA明显高于健康人[1,11-14]。经研究发现，次级胆汁酸可以改变肠上皮细胞增殖、分化、凋亡的平衡，通过表皮生长因子受体、WNT/β-catenin等相关信号通路干扰肿瘤抑制，促进肿瘤生长[5,9]。在对结肠癌细胞系HCT116的研究中发现，次级胆汁酸可抑制抑癌基因p53的翻译、表达[3,15]。在肝癌中，次级胆汁酸被重新吸收后可以对肝脏造成损伤，包括DNA断裂，进而引发肝细胞老化，老化的肝细胞则会分泌促进癌变的蛋白质[16]。另一方面，有研究发现肝病患者小肠细菌过度生长的发生率较高，并且其发生率会随着肝功能不全程度的加重而提高。肝细胞肝癌患者发生小肠细菌过度生长的机制可能与胆汁酸的缺乏有关[17]。此外，次级胆汁酸还可作用于基底细胞和化生上皮，分泌血管内皮生长因子，加快肿瘤血管生成，利于肿瘤的浸润、转移。

2 模式识别受体：Tolll样受体 4

Toll样受体（Toll like receptor，TLR）是一种模式识别受体，是近年来学者们的研究热点。TLR4信号通路的激活，可以增强抗肿瘤的免疫反应。但TLR4还可激活肿瘤细胞中的核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路以产生炎性因子和趋化因子，从而促进肿瘤的生成和转移[7,18-19]。已有多个研究结果表明，TLR4信号通路的激活，与肝炎、肝硬化和肝癌的发生有着密切联系[11,17,20]，该通路激活后，肿瘤细胞得到了有利于生存的微环境，逃避了机体的免疫攻击，进而起到了抑制肝癌细胞凋亡的效果。但给予一定的益生菌后，抑制现象可被减缓[21]。另一方面，在结直肠癌的研究中，模式识别受体与肿瘤的发生密切相关[5]。炎症小体是由模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，是机体固有免疫系统的重要组成部分。Elinav等[22]发现炎症小体与肠道菌群的相互作用在肠道炎症和肿瘤的发展中具有重要作用。缺失炎症小体的小鼠表现出血清白细胞介素-18（interluekin-18，IL-18）水平降低和严重的结肠炎，同时伴随普氏菌增多，引起肠道中C-C趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）的水平增高，进而大量招募淋巴细胞分泌IL-6，最终引起肠道炎症和结肠癌的发生[22]。

3 肠道菌群在环磷酰胺抗肿瘤免疫反应中的作用

环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是美国食品药品管理局批准的一种成功抗癌烷化剂。CTX由于其高免疫抑制特性，已被广泛应用于与其他抗肿瘤药物的联合疗法[23]，在国内，也已成为临床常用的抗肿瘤药物。有研究表明，CTX除了其自身具有的细胞毒性外，还可诱导免疫原性细胞死亡，进而引导机体产生自适应抗肿瘤免疫反应[24]；同时还可破坏免疫抑制性T细胞，协助辅助性T细胞1（T-helper 1，Th1）和Th17起到控制肿瘤细胞增殖的作用[25]。Viaud等[26]通过研究发现，CTX可以通过改变已建模的荷瘤小鼠小肠的肠道菌群组成，并诱导某些革兰阳性细菌迁移至二级淋巴器官。迁移之后，这些革兰阳性细菌会刺激致病性Th17（pathogenic Th17，pTh17）与记忆性 Th1免疫反应的形成，从而提高CTX杀伤肿瘤的效果。然而，实验进一步发现，无菌的荷瘤小鼠和已接种杀死革兰阳性细菌抗生素的小鼠的pTh17免疫反应明显减弱，且小鼠肿瘤对CTX产生耐药现象。该研究还发现，通过对无菌小鼠或经抗生素处理过的小鼠进行过继转移pTh17细胞，小鼠体内的CTX抗肿瘤效果则会被部分修复。上述研究表明，肠道菌群可以帮助形成抗肿瘤免疫反应，增强CTX的抗肿瘤疗效。

4 CpG寡核苷酸与肠道细菌

TLR9是免疫系统检测微生物DNA内非甲基化CpG基序的模式识别受体。一旦出现上述CpG基序，CpG寡核苷酸（oligonucleotide，ODN）即可结合浆细胞样树突状细胞和B细胞上的TLR9，诱导肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎性因子的释放，促进肿瘤出血性坏死，提高机体的免疫应答反应[24]。有研究表明，对于肿瘤患者，只有CpG-ODN与肽疫苗联合应用才能达到预计的抗肿瘤免疫反应效果，而单独使用CpG-ODN则无此反应。但对于小鼠，则有明显的不同。小鼠体内的TLR9广泛分布于髓系细胞，体内注射CpGODN，特别是与抗白细胞介素-10抗体（anti-interleukin-10 antibody,a-IL-10 ab）联合应用时，可以有效针对移植性肿瘤。其机制与CpG-ODN刺激释放促炎性因子，诱导肿瘤出血坏死有关。值得注意的是，无菌小鼠或是经抗生素处理后的小鼠，则无法获得相应的抗肿瘤效应。同时可以发现，对于上述菌群缺乏的小鼠，髓系细胞内诱导肿瘤出血坏死的IL-12与TNF的表达明显减少。而一旦接种TLR4配体细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又可恢复CpG-ODN的抗肿瘤效应[27]。通过对联合使用CpG-ODN和a-IL-10 ab的动物进行菌群分析，可以发现不同的细菌种类与药物的抗肿瘤效应呈正相关或负相关。例如，革兰阴性菌Alistipes genera的丰度与TNF的产量呈正相关[28]。

Iida等[29]对荷瘤小鼠进行CpG-ODN的抗肿瘤免疫治疗，治疗前小鼠已接受3种抗生素混合物[万古霉素、亚胺培南和新霉素（ABX）]的治疗，发现治疗效果并不理想。研究结果表明抗生素作用显著破坏了小鼠肿瘤细胞中CpG-ODN诱导型TNF的表达及白细胞产生的频率，且TNF减少、活性氧簇产生不足，细胞毒性显著降低，因此导致肿瘤治疗效果减弱。为了验证治疗效果是否与ABX有关，该研究随后分别采用无菌荷瘤小鼠及SPF荷瘤小鼠接受CpG-ODN治疗，结果表明无菌小鼠对于CpG-ODN的治疗反应明显不如SPF荷瘤小鼠。而进一步研究发现使用外源性的TLR4激动剂（LPS）后，可改善ABX小鼠TNF的释放情况，并能修复其肿瘤细胞中TNF的表达及白细胞产生的频率，但上述现象在TLR4缺失的小鼠中并未发生。

上述研究结果表明，肠道菌群与CpG-ODN的抗肿瘤效果相关，强调了肠道菌群在肿瘤治疗中的重要性。

5 经肠道杆菌酵解形成的短链脂肪酸

短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）是肠道内杆菌酵解未消化吸收的碳水化合物形成的代谢产物，包括乙酸、丙酸和丁酸等[30-32]。现已有研究证明，SCFA具有抗肿瘤活性，且主要源于游离羧基和双键[33]。SCFA的代谢产物丁酸是结肠和小肠上皮细胞的主要供能物质，且是一种有效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，它被证实具有抑制结肠癌细胞增殖的作用[34]。Bultman[35]阐述了由于肿瘤细胞内存在Warburg效应，因此肿瘤细胞会优先利用糖类进行无氧呼吸。如此丁酸盐就会进入肿瘤细胞核内发挥其组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用，从而达到抗肿瘤作用。Singh等[36]发现丁酸盐的抗癌机制与丁酸盐受体109A相关，此受体同时也是烟酸受体，由NIACR1基因编码。在NIACR1基因敲除小鼠的实验中，小鼠患炎症和结直肠癌的风险显著增加[37]。Mangeney等[38]的研究表明，SCFA能诱导Treg细胞扩张，产生抗炎因子IL-10，从而抑制结肠炎症和癌变的发生。SCFA也会通过受体介导和受体依赖两种机制影响宿主基因的表达模式，促进细胞增殖和细胞凋亡。相关研究显示SCFA与其激活的GPR43可降低白血病细胞的增殖率[39]。

6 肠道细菌与免疫检查点阻断

近年来，免疫检查点的研究使得临床抗肿瘤治疗取得了新的突破。其中，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA4）、程序性死亡受体-1（programmed cell death 1，PDCD1，也称 PD-1）或程序性死亡受体配体-1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）是热门的研究靶点[40-43]。这些靶点的抑制剂，如CTLA4单克隆抗体（anti-CTLA4 monoclonal antibody，aCTLA4 mAb）与PD-L1单克隆抗体（anti-PD-L1 monoclonal antibody，aPD-L1 mAb）的临床应用可增强机体对肿瘤的免疫反应。已有研究报道，aCTLA4 mAb等抗体在治疗晚期黑色素瘤、肾癌和肺癌中表现出显著的临床疗效[44]。aCTLA-4 mAb可阻断CTLA4与其配体相互作用，清除肿瘤微环境中的Treg细胞，促进细胞毒性T细胞的浸润而清除肿瘤[23]。PD-1/PD-L1的动物实验表明PD-1通路参与了肿瘤的免疫逃逸，而aPD-L1 mAb可恢复抗肿瘤免疫反应[45]。综上所述，免疫检查点的阻断确实有效，然而以往的基础实验主要集中于免疫系统的研究，而现今已有更多的学者开始关注肠道菌群在其中发挥的作用。Vétizou等[46]发现，aCTLA4 mAb对无菌小鼠或经抗生素处理后的荷瘤小鼠治疗无效，这是因为aCTLA4 mAb诱导肠道黏膜损伤，引起细菌移位及树突状细胞浸润，树突状细胞的作用是增加aCTLA4 mAb的抗菌作用、抗肿瘤作用。如此说明肠道菌群可通过调节树突状细胞功能控制aCTLA4 mAb的疗效。通过进一步的研究发现，拟杆菌属可显著提高aCTLA4 mAb的疗效[24]。而无菌小鼠对aCTLA4 mAb治疗反应的缺失可通过类杆菌的定植、脆弱拟杆菌多糖诱导的免疫反应或过继性转移脆弱拟杆菌特异的Th1细胞而修复。在另一项研究中，Sivan等[47]发现JAX小鼠和TAC小鼠中，有不同肠道菌群的同种小鼠皮下黑色素瘤的生长率存在显著差异，而将两种小鼠共同培养可消除免疫反应的差异，结果提示肠道菌群的差异可能影响小鼠的抗肿瘤免疫反应。通过进一步的研究发现，小鼠体内的双歧杆菌可增强PD-1/PD-L1抗体的抗肿瘤作用。综上所述，随着对肠道菌群在免疫检查点抑制方面不断的深入研究，抗肿瘤免疫治疗有望得到新的突破。

7 过继性细胞免疫治疗

过继性细胞免疫治疗是将肿瘤内具有抗肿瘤活性的淋巴细胞体外扩增后输入患者体内直接杀伤或激发免疫反应杀伤肿瘤细胞[43]。全身照射（total body irradiation，TBI）或大剂量化疗可清除体内的抑制性淋巴细胞，激活抗原呈递细胞，促进肠道菌群移位，升高血浆的LPS水平，从而通过TLR4信号通路增强CD8+T细胞的抗肿瘤活性[24,33]。有研究表明，肠道菌群受到影响、血浆LPS被中和或TLR4遗传缺陷的小鼠去除LPS后均会显著降低TBI的肿瘤抑制作用[48]。

8 肠道菌群对铂类、核苷类似物疗效的影响

铂类化合物是目前临床常用的抗肿瘤化疗药物，如顺铂、奥沙利铂等。Iida等[29]发现ABX可干扰铂类化合物对小鼠皮下移植瘤的杀伤作用，且无菌小鼠比无特定病原菌小鼠对化疗药物的反应更差。该结果提示肠道菌群对铂类化合物的疗效有着重要的影响。该研究认为铂类化合物的抗肿瘤作用可能是依赖肠道菌群驱动肿瘤浸润髓源细胞释放活性氧簇，从而诱导DNA损伤杀伤肿瘤细胞[29]。

核苷类似物是一类可干扰肿瘤细胞DNA合成的抗代谢药物，主要用于抗病毒、提高机体免疫力、恢复肝功能。有研究报道肠道菌群代谢某些核苷类似物如卡培他滨、氟达拉滨后使其肿瘤杀伤毒性增强，但是克拉屈滨、吉西他滨等被肠道菌群代谢后活性明显减低[49]。

9 小结与展望

综上所述，肠道菌群不仅可以影响多种肿瘤的发生与发展，而且在肿瘤的防治中起到至关重要的作用。然而，尽管现代研究对肠道菌群抗肿瘤的机制有了一定认识，但仍有待进一步深入研究，且从实验研究到临床应用的转化仍需广大学者共同努力。