黄连素对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及其机制

张君红，李洪梅，黄雪，井洁，张湘莲，余明华，石榴

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

溃疡性结肠炎(UC)以反复腹泻、腹痛、黏液脓血便等消化道症状为主，伴有发热、乏力、消瘦等全身反应，以及坏疽性脓皮病、口腔复发性溃疡、外周关节炎及眼部病变、肝胆疾病等一系列肠外表现，严重者可并发中毒性巨结肠、结直肠癌变、大出血等，威胁患者生命。西药治疗UC具有规律性、快速性及高效性，但难以根治，且复发率高。研究发现，中药治疗UC不仅能长期缓解症状，还可减少复发，且疗效显著[1]。黄连具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等功效[2]，用于治疗湿热泻痢效果良好。黄连素是黄连的主要有效成分，而湿热泻痢临床表现与UC类似。2015年6月～2018年5月，我们将黄连素作用于UC大鼠，观察其治疗作用，并探讨其作用机制，旨在为UC的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 清洁级SD大鼠24只，体质量180～220 g，雌雄各半，均购于广西医科大学动物实验中心及饲养员标准饲养。硫酸葡聚糖钠盐(DSS)购自美国MP公司，用蒸馏水配制成浓度5.5%的DSS溶液。黄连素购自桂中大药房。人与大鼠用药剂量的换算：大鼠用药剂量=人临床用药剂量(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g，黄连素成人临床用量为900 mg/d，换算成大鼠用量为100 mg/kg。DAB试剂盒购自中杉金桥公司，ELISA试剂盒购自华美公司，逆转录试剂盒购自Thermo公司，扩增试剂盒购自TaKaRa公司，4%多聚甲醛、水合氯醛、大便隐血测定试剂盒等试剂和耗材购自南宁市品胜实验用品经营店。

1.2 动物分组造模与给药处理 将大鼠随机分成正常组、模型组、黄连素组各8只。模型组及黄连素组自由饮用DSS溶液诱导UC形成，正常组自由饮用蒸馏水，连续7 d。计算模型组、黄连素组、正常组的疾病活动指数(DAI)评分，模型组及黄连素组DAI评分均高于正常组(P均<0.01)，造模成功。从第8天开始，3组均自由饮用蒸馏水，黄连素组给予黄连素100 mg/kg灌胃，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，1次/d，连续7 d。

1.3 疾病活动度评价 记录大鼠的一般情况，包括体质量、大便性状、毛发光泽度、精神状态、是否易激惹等，用大便隐血测定试剂盒(干化学法)测定大便出血情况。于造模第7天和第14天采用DAI评分评价疾病活动度。具体评分标准：体质量未下降为1分，下降1%～5%为1分，下降6%～10%为2分，下降11%～15%为3分，下降>15%为4分；大便性状正常为0分，松软为2分，腹泻为4分；大便出血阴性为0分，+为1分，++为2分，+++为3分，肉眼血便为4分。DAI=(体质量下降分数+大便性状分数+大便隐血情况分数)/3。

1.4 血清IL-9水平检测 采用ELISA法。实验第15天，将大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，固定，沿正中线切开腹部，从下腔静脉采血，离心取上清液，低温保存。取血清标本加入生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃温育1 h，洗板，甩干；加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37 ℃温育1 h，洗板，甩干；加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色30 min；加入终止液终止反应，上酶标仪于450 nm波长处测量吸光度OD值。

1.5 结肠组织病理学检查 取出大鼠整段结肠冲洗干净，剪取病变明显的组织约1 cm，加入4%甲醛溶液固定，制作病理切片。行HE染色，光学显微镜下观察炎症程度、病变深度、陷窝破坏程度、炎症范围，分别进行评分。炎症程度评分：无炎症为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；病变深度评分：无病变为0分，病变累及黏膜层为1分，累及黏膜下层为2分，累及肌层为3分，累及浆膜层为4分；隐窝破坏程度评分：无隐窝破坏为0分，基底1/3隐窝被破坏为1分，基底2/3隐窝被破坏为2分，仅有完整表面上皮为3分，全部隐窝和上皮被破坏为4分；炎症范围评分：无病变为0分，病变范围1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。以四项评分的乘积计算结肠组织病理学评分。

1.6 结肠组织TLR2蛋白表达检测 采用SP免疫组化法。将结肠组织切片常规脱蜡至水，3% H2O2孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶活性。滴加血清封闭液，室温孵育10 min；滴加一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；滴加二抗，室温孵育10 min，PBS洗涤。加入DAB显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，清水中浸泡返蓝，中性树胶封片，显微镜下观察。每张切片选取5个棕黄色颗粒最多且互不重叠的视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞所占百分比。

1.7 结肠组织TLR2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取结肠组织标本，采用TRIzol法提取组织RNA，检测RNA浓度。Thermo逆转录试剂盒反应合成cDNA。内参GAPDH引物序列：上游5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′，下游5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′，产物长度85 bp。TLR2引物序列：上游5′-AGCAGGATTCCTATTGGGTGGAG-3′，下游5′-ATGATCCATTTGCCCGGAAC-3′，产物长度112 bp。扩增体系(20 μL)：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.8 μL，无酶水7 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 三组DAI评分比较 模型组和黄连素组于造模第1天即出现黏液便及松软大便，第2天出现大便隐血+。随时间延长，两组陆续出现软便、烂便及血便，肛周污秽，毛发晦暗凌乱，精神萎靡，体质量不同程度下降。第7天模型组、黄连素组、正常组的DAI评分分别为(2.25±0.66)、(2.33±0.62)、0分，模型组及黄连素组DAI评分均高于正常组(P均<0.01)。黄连素组予黄连素灌胃后，稀烂便及血便症状逐渐消失，体质量逐渐增加，精神状态好转，毛发逐渐恢复光泽。第14天模型组和黄连素组的DAI评分分别为(2.58±0.35)、(2.04±0.52)分，黄连素组DAI评分低于模型组(P<0.05)。

2.2 三组结肠组织病理学观察 正常组结肠组织结构完整，腺体排列规整、无缺损，偶见炎性细胞浸润；模型组结肠组织腺体结构紊乱或消失，部分可见黏膜糜烂，隐窝结构变形，可见大量炎性细胞浸润；黄连素组结肠组织腺体排列紊乱，炎性细胞数量较模型组减少。模型组、黄连素组、正常组的结肠组织病理学评分分别为(5.33±1.47)、(3.70±1.86)、(0.44±0.32)分，模型组、黄连素组病理学评分均高于正常组，黄连素组较模型组下降(P均<0.05)。

2.3 三组血清IL-9水平比较 模型组、黄连素组、正常组血清IL-9水平分别为(229.36±99.51)、(95.20±30.68)、(36.07±14.62)pg/mL，模型组、黄连素组血清IL-9水平均高于正常组，黄连素组较模型组下降(P均<0.05)。

2.4 三组结肠组织TLR2蛋白及mRNA表达比较 模型组、黄连素组TLR2蛋白及mRNA表达均高于正常组，黄连素组较模型组下降(P均<0.05)。见表1。

表1 三组结肠组织TLR2蛋白mRNA表达比较

注：与模型组比较，*P<0.01。

3 讨论

UC以结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症病变为主，通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延。UC是一种顽固性疾病，严重危害人类健康，然而其发病机制目前尚不明确。研究认为，环境因素及免疫因素在其发病过程中具有重要作用。目前治疗该疾病的药物有糖皮质激素、5-氨基水杨酸、免疫抑制剂、生物制剂等，治疗疗程长，易反复，且费用高。中医学认为，UC属于“久泻”“久痢”“痢疾”等范畴，以脾胃虚弱为主，饮食不洁、先天禀赋不足、外感风邪为主要的发病诱因，多发病于秋冬季节。其辨证分型可分为大肠湿热证、热毒炽盛证、脾虚湿蕴证、寒热错杂证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、阴血亏虚证[3]。初发型及慢性复发型以大肠湿热证最常见，慢性持续型以脾肾阳虚证最常见。黄连素具有清热、解毒、抗炎、抑菌等作用，属于非甾体类抗炎药，早期主要用于治疗肠道细菌感染导致的腹泻，但其抑菌作用较微弱，目前只发现对痢疾杆菌、大肠杆菌引起的肠道感染有效。大量研究证实，黄连素治疗UC效果良好，其可能通过调整肠道微生态环境、保护肠道结构完整性、调节细胞或体液免疫等发挥治疗作用[4]。

唐少秋等[5]用黄连素治疗老龄UC大鼠，发现黄连素能通过抑制激活核因子κB(NF-κB)的活化，减少TNF-α等炎症因子的表达，达到抗炎疗效，从而保护组织结构，保护肠道黏膜屏障功能。本研究结果显示，UC大鼠给予黄连素治疗后，大鼠腹泻、便血、体质量下降等症状得到改善，毛发恢复光泽，精神状态好转；黄连素组DAI评分较模型组下降，而模型组、黄连素组DAI评分均高于正常组。表明黄连素能减轻结肠炎症反应，缓解UC大鼠消化道症状，从而起到治疗UC的作用。

张仁霞等[6]报道，黄连素可明显降低复合性UC大鼠DAI及结肠组织病理学评分，降低IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达，改善结肠病理改变，促进肠黏膜愈合。本研究结果显示，模型组、黄连素组结肠组织病理学评分均高于正常组，而黄连素组评分较模型组下降，表明黄连素在治疗UC大鼠过程中，可通过改善结肠组织病理结构，起到促进肠道黏膜愈合的作用。

IL-9在免疫性疾病、过敏性疾病、慢性炎症及肿瘤等多种疾病中发挥重要作用[7]。Nalleweg等[8，9]报道，IL-9参与了UC的发病过程，使用IL-9抗体中和小鼠体内的IL-9，UC小鼠消化道症状及全身症状缓解，炎症指标下降，且与疾病严重程度呈正相关；认为IL-9能促进UC疾病进展，导致肠黏膜损伤。IL-9是通过紧密连接分子改变结肠组织屏障参与炎症反应，使构成紧密连接的结构蛋白发生变化，导致肠道黏膜通透性增加，炎症反应扩大，最终影响结肠组织溃疡的愈合[10]。本研究结果显示，模型组、黄连素组血清IL-9水平均高于正常组，且黄连素组较模型组下降，表明IL-9参与了UC的发病过程，通过降低血清IL-9水平可起到治疗UC的效果。

TLR2是TLRs家族成员之一，能够识别病原体相关分子模式(PAMPs)，通过激活下游信号传导分子，激活NF-κB，导致炎症因子表达升高，最终引发肠道黏膜免疫反应[11]。郎晓猛[12]报道，UC模型大鼠结肠组织TLR2 mRNA及TLR2蛋白的表达水平明显偏高，予药物干预治疗后，大鼠体内的TLR2 mRNA及蛋白表达降低，消化道症状缓解，炎症评分下降，考虑TLR2在对肠道PAMPs进行模式识别的过程中，可激活NF-κB，过量的TLR2会大规模激活NF-κB，使得炎性因子过度表达，导致炎症的扩大发生。也有研究表明，激活的NF-κB又可促进TLR2表达，形成TLR2-NF-κB-TLR2循环，从而产生持续扩大的炎症反应[13，14]。本研究结果显示，模型组、黄连素组大鼠结肠组织TLR2 mRNA及蛋白表达高于正常组，而黄连素组较模型组有所下降。说明正常结肠组织中TLR2表达量不高，但在UC模型中，TLR2表达量明显增高，表明TLR2在UC发展中具有重要作用，可促进结肠炎症发生发展；通过降低UC大鼠TLR2 mRNA及蛋白表达，可起到减轻结肠炎症反应、缓解消化道症状的作用。

综上所述，黄连素能够改善UC大鼠的疾病活动度，减轻结肠组织的病理损伤程度，对UC大鼠具有治疗作用。其机制可能是通过降低血清IL-9水平、抑制TLR2蛋白和TLR2 mRNA表达,从而维持机体内促炎症因子与抑炎症因子平衡，修复局部结肠黏膜免疫功能，进而维持机体微生态环境稳定，恢复肠黏膜屏障保护功能。