慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中IGF-1、IGFBP3表达及其与气道重塑的关系

唐诗帅，张伟兵，田晓彦，陈晓明，李佳宁，何秋馥

(哈尔滨医科大学附属第四医院，哈尔滨150001)

当气道受到有害气体或细菌、病毒等入侵后，肺组织内损伤和修复交替出现，引起气道周围细胞增生，细胞外基质沉积，最终导致管壁增厚、管腔狭窄，这一过程称为气道重塑[1]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以进行性肺功能下降和慢性气道炎症为特征的呼吸系统疾病，气道重塑是COPD患者肺功能逐渐下降的关键因素。研究表明，气道重塑过程中存在着相关细胞增殖与凋亡的调节异常。胰岛素样生长因子1(IGF-1)作为一种内分泌因子，可诱导多种细胞增殖分化，抑制细胞凋亡。IGF-1作用于多种炎症介质，促进上皮细胞下层的胶原沉积，平滑肌增生[2]。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)通过调控IGF-1的生物活性及其他信号通路调控细胞的有丝分裂和凋亡，在特发性肺纤维化肺组织的异常重塑中占重要地位[3]。2017年10月～2018年1月，我们通过制作COPD大鼠模型，观察大鼠肺组织中IGF-1、IGFBP3的表达情况，探讨COPD气道重塑的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 6～7周龄雄性Wistar大鼠20只，SPF级，体质量(170±10)g,购自青岛实验动物中心。饲养于温度22 ℃、相对湿度40%～60%的环境中，12 h光照/12 h黑暗，自由饮食，常规饲养7 d后进行实验。长白山牌香烟由吉林烟草工业有限责任公司生产，兔抗大鼠IGF-1、IGFBP3多克隆抗体一抗购自BioVision公司，二抗PV6001及DBA显色剂购自上海由谊忠联生物公司。IGF-1、IGFBP3引物合成由Invitrogen公司合成，IGF-1及IGFBP3总RNA提取试剂购自Ambion公司，反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自上海纪宁实业有限公司，Tanon1600凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司，实时荧光定量PCR仪购自济南威灵医疗器械有限公司。

1.2 动物分组与模型制备 将大鼠随机分为对照组和模型组各10只。模型组采用香烟烟熏法制备COPD模型，将大鼠放入熏烟箱内，每次放入10支香烟点燃，持续30 min，3次/d，连续90 d。对照组正常饲养。造模过程中死亡的大鼠，以相同条件下饲养的备用大鼠补充。

1.3 一般情况观察 造模期间每天测定大鼠体质量，观察大鼠精神、饮食、活动情况。

1.4 肺组织形态学观察 造模完成后，麻醉并固定大鼠，开胸取左肺下叶，置于甲醛溶液中固定24 h后，沿垂直支气管走向最大横径处切取4 mm厚组织，流水冲洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片。取肺组织石蜡切片，常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，流水冲洗。置入80%乙醇3 min，伊红染色5 min。分别放入100%乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5 min，中性树胶封片。光镜下观察肺组织形态结构及周围炎症细胞浸润情况。

1.5 细支气管管壁厚度测定 取大鼠肺组织后，沿垂直支气管走向最大横径处切取4 mm厚气管组织，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，常规HE染色。每张HE切片选取2～3个直径小于1 000 μm的细支气管，以单位长度管壁面积表示管壁厚度，用图像分析系统测量每个细支气管管壁厚度。

1.6 肺组织IGF-1、IGFBP3蛋白表达检测 采用免疫组化染色法。取大鼠右肺组织切片，常规脱蜡至水，3% H2O2孵育10 min，放入pH=6的枸橼酸钾缓冲液中，微波炉加热进行抗原修复。滴加一抗，4 ℃孵育12 h，PBS冲洗，滴加PV6001及二抗，37 ℃孵育0.5 h，PBS冲洗，滴加DAB溶液显色，常规脱水，封片，镜下观察。IGF-1、IGFBP3蛋白阳性结果为黄棕色颗粒，位于细胞核。每张切片随机选取4个点，计算其积分光密度(IOD)值，取均值作为该标本IGF-1、IGFBP3蛋白的表达量。

1.7 肺组织IGF-1、IGFBP3 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。取大鼠右肺组织，加入TRIzol提取总RNA，逆转录合成cDNA。将获得的cDNA按照PCR试剂盒说明书方法扩增目的基因。引物序列：GAPDH上游5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′，下游5′-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3′，片段长度131 bp；IGF-1上游5′-GCATTGTGGATGAGTGTTGC-3′，下游5′-ATAGGGGCTGGGACTTCTG-3′，片段长度147 bp；IGFBP3上游5′-GGCGTCCACATCCCAAAC-3′，下游5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′，片段长度144 bp。反应条件：70 ℃ 5 min，85 ℃ 5 s；95 ℃ 30 s；共40个循环。计算Ct值，应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 两组一般状态比较 对照组饮食良好，灵敏好动，毛发光泽，无咳嗽喘息，体质量稳定增长，烟熏2周后模型组饮食减少，精神倦怠，无力，常有挠鼻现象，咳嗽喘息，毛发枯黄，眼周鼻周有红色分泌物，体质量无明显增加。

2.2 两组肺组织形态学比较 对照组肺脏光滑、红润；观察组肺脏体积增大，颜色苍白，弹性减弱。镜下可见对照组支气管及肺泡结构正常，形态清晰；模型组气道上皮坏死脱落，纤毛排列紊乱、脱落，平滑肌束增生、肥大，管壁黏膜下层及肌层有大量炎细胞浸润，肺泡明显扩张，壁变薄并断裂，相邻肺泡构成较大囊腔。

2.3 两组细支气管管壁厚度比较 对照组和模型组均观察了27个细支气管，管壁厚度分别为(31.47±5.29)、(50.72±7.7)μm2/μm，模型组细支气管管壁厚度较对照组升高(P<0.01)。

2.4 两组肺组织中IGF-1、IGFBP3蛋白及mRNA表达比较 模型组IGF-1、IGFBP3蛋白及mRNA表达均高于对照组(P均<0.01)。见表1。

表1 两组肺组织中IGF-1、IGFBP3蛋白及mRNA表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.5 肺组织中IGF-1、IGFBP3蛋白表达与细支气管管壁厚度的相关性 COPD组肺组织中IGF-1蛋白表达与IGFBP3蛋白表达呈正相关(r=0.81，P<0.01)，IGF-1、IGFBP3蛋白表达均与细支气管管壁厚度呈正相关(r分别为0.658、0.654，P均<0.01)。

3 讨论

COPD是常见的呼吸系统疾病，其患病率高，治疗困难，病情呈进行性发展，最终导致患者呼吸困难及严重并发症而死亡，给社会经济造成巨大负担。气道重塑是COPD病情不断进展并引起其他严重并发症的重要原因。研究表明，气道重塑过程中存在着相关细胞增殖与凋亡的调节异常。IGF-1作为体内不可或缺的生长因子，存在于人类肺部的气道上皮细胞、纤维母细胞等多种细胞中[4]。IGF-1主要通过结合胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)，激活丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等下游信号通路，调控细胞的增殖分化[5]。Chand等[6]报道，暴露在香烟烟雾中的大鼠胞质内的IGF-1可通过作用于IGF-1R和表皮生长因子受体通路诱导Bcl-2基因的表达,促使气道上皮细胞不断增生。Takasaka等[7]研究表明，组蛋白去乙酰化酶6通过抑制IGF-Akt信号通路来诱导暴露在香烟提取物中的人气道上皮细胞的自噬。Pineiro-hermida等[8]报道，在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，IGF-1通过激活胰岛素受体底物2和PI3K通路调控纤维母细胞的存活和迁移，促进基质蛋白的沉积。本研究结果显示，COPD大鼠肺组织中IGF-1蛋白及mRNA表达升高，且IGF-1蛋白表达与细支气管管壁厚度呈正相关，进一步说明IGF-1通过促进气道重塑参与了COPD的发生发展。

IGFBP3是体内含量最丰富的一种胰岛素样生长因子结合蛋白，通过竞争性结合IGF-1，延长IGF-1的半衰期、限制IGF-1与其受体的结合来调控IGF-1的生物活性[9]。IGFBP3作为一种多功能蛋白，除了作用于胰岛素样生长因子(IGFs)外，还可通过与其他蛋白或其受体相互作用调控细胞的增殖和凋亡[10]。IGFBP3作用机制复杂，对IGFs既能起正向调节作用也能起负向调节。研究显示，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的细胞凋亡和IGF-1诱导的细胞增殖都需要IGFBP3参与。孔海波等[11]报道，在同样的细胞内IGFBP3可发挥刺激因子和抑制因子两种作用。Tan等[12]报道，IGFBP3蛋白和mRNA在特发性肺纤维化患者的纤维母细胞中高表达，通过与IGF-1结合促进IGFBP3分泌。Jiao等[13]发现，在暴露于香烟烟雾提取物中的肺泡上皮细胞中，IGFBP3蛋白及mRNA高表达，考虑其在肺气肿的发生发展中发挥了重要作用。本研究结果显示，COPD大鼠肺组织中IGFBP3蛋白及mRNA表达升高，且IGFBP3蛋白与IGF-1蛋白表达呈正相关，考虑两种因子在促进COPD气道重塑过程中起了协同作用，其具体机制需进一步研究。

综上所述，COPD大鼠肺组织中IGF-1、IGFBP3表达升高，二者共同促进了COPD的气道重塑。由于COPD无法治愈，目前临床上主要以缓解症状、对症治疗为主，并不能阻止气道重塑的发展。通过研究IGF-1、IGFBP3在气道重塑中的作用和机制，可为COPD的病因治疗提供新的研究方向。