中药复方筋脉通对高糖培养SD大鼠背根神经元凋亡及NGF表达的影响

吴亚楠 梁晓春 杨丹

(1北京协和医院中医科，北京 100730；2昆明医科大学第一附属医院)

神经元的凋亡及神经再生修复能力的减弱是糖尿病神经病变发生的根本原因之一〔1〕。因此如何减少神经元凋亡、促进神经的修复与再生是糖尿病神经病变防治的重要内容〔2,3〕。高糖状态下神经生长因子(NGF)水平的降低是导致神经元再生修复障碍或细胞凋亡的重要原因之一〔4～6〕。本研究拟观察中药筋脉通含药血清对神经元中NGF的表达及细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 从中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心购置孕15天(E15)的SPF级SD大鼠，动物许可证号：SCXK-(军)2012-0004，从胎鼠中提取背根神经节用于培养原代细胞。SPF级雄性SD大鼠，体重280～320 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001，用于制备含药血清。

1.2实验用药 筋脉通胶囊(由菟丝子、女贞子、水蛭、桂枝、元胡、细辛等组成)，由北京九龙制药厂加工生产，每粒含生药0.35 g，批准文号(97)京卫药制加字〔48〕第F-292号，生产批号061019。牛磺酸，产品编号T457l，购自Sigma公司。

1.3主要试剂和仪器 Neurobasal培养基(Gibco)，0.05%胰蛋白酶，0.25%胰蛋白酶，1%胶原酶Ⅱ(国家细胞资源平台)，胎牛血清(FBS，Hyclone)，多聚赖氨酸(Sigma)，B27(Gibco)，淋巴细胞分离液(北京中杉金桥公司)，5-氟尿嘧啶、聚乙二醇单辛基苯基醚(TritonX-100)(Sigma)，NGF(Merck Millipore)，抗NGF抗体兔来源多克隆(Abcam)，微管相关蛋白(MAP)-2兔来源多抗(Millipore)，辣根过氧化物标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)，荧光标记原位末端转移酶(TUNEL)试剂盒(Roche)，蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)配制试剂盒(Sigma)，原位逆转录酶Ⅲ反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒 (Invitrogen)，光学显微镜、倒置相差显微镜(Olympus)，Line-gene荧光定量PCR检测系统(杭州博日科技有限公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，激光共聚焦显微镜(Leica)。

1.4方法

1.4.1含药血清的制备 取20只雄性SD大鼠饲养于SPF级环境中，将大鼠随机分为筋脉通(JMT)组5只，牛磺酸(Tau)组5只，正常对照(Con)组10只，治疗组给药剂量按成人剂量的15倍计算〔即JMT:1.31 g/(kg·d)；Tau:1.2 g/(kg·d)〕；Con组给予等体积蒸馏水。每日灌胃2次，连续7 d。于末次灌胃后2 h内颈动脉插管取血。室温静置2 h后，低温离心机4 000 r/min离心10 min分离血清，水浴灭活后分装为1 ml/支，-80℃冰箱保存，0.22 μm滤器过滤灭菌后使用。

1.4.2DRGn的原代培养、纯化及鉴定 12%乌拉坦按1 ml/100 g的剂量腹腔注射深度麻醉孕鼠，消毒孕鼠下腹部，剪开腹部取出子宫，无菌条件下逐个将胎膜剪破取出胚胎，在5倍解剖显微镜下用显微镊剖开胎鼠背部的皮肤，纵向分离组织，打开髓腔，小心分离椎管内的脊髓，然后摘取脊髓两侧呈串珠状的背根神经节，预冷的去离子平衡盐溶液(D-Hanks)液冲洗，眼科剪充分剪碎组织至1 mm3，加入混合消化酶10 ml(配制比例为0.1%胶原酶：0.125%胰蛋白酶=3∶1)消化10～15 min，用完全培养基终止消化，尖头吸管小心反复吹打，直至细胞悬液呈云雾状，200目筛网过滤，收集细胞悬液。在15 ml离心管中加入淋巴细胞分离液6 ml，将4 ml细胞悬液沿管壁缓慢滴加于分层液面上，2 000 r/min离心20 min；用细吸管插入中层絮状区吸取细胞，置入另一50 ml离心管中，D-Hanks液重悬，再次离心弃上清。完全培养基重悬细胞并置于T75培养瓶中进行差速贴壁1 h，将贴壁较慢的神经元细胞吸出，吸取10 μl细胞悬液进行计数。按2×106/孔接种于6孔板中。4～6 h后弃完全培养基，换用无血清神经元专用培养基，培养24 h后进行MAP-2蛋白免疫荧光鉴定。刚接种的DRGn在显微镜下较为均匀，胞体呈圆形，有折光性。培养6 h后,神经元贴壁,少量死亡细胞漂浮，部分神经元开始长出短小突触。换用无血清培养基培养24 h后，贴壁的神经元体积较前明显变大，胞体成近圆形,向四周发出树枝状轴突,轴突相互连接形成交联网络状。培养48 h后神经元胞体进一步增大,胞体可呈类圆形或三角形,同时胞体相互聚集，呈簇状分布，周围折光性强,轴突进一步增多，并相互交错形成更加密集的纤维网络。

1.4.3细胞鉴定 将DRGn细胞悬液以2×106/孔的密度接种于放置盖玻片〔预先包被多聚赖氨酸(PDL)〕的6孔板中，细胞生长至第2天，取出盖玻片进行细胞鉴定。4%多聚甲醛固定，漂洗后滴加0.1% Triton-X100常温孵育，然后加入山羊血清封闭液与非特异性蛋白结合，漂洗后每个盖玻片加入20 μl 1∶200稀释的MAP-2抗体，4℃过夜，阴性对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。先后加入20 μl 1∶100稀释的异硫氰酸酯(FITC)耦联山羊抗兔IgG及二脒基苯基吲哚(DAPI)工作液常温孵育。用激光共聚焦显微镜进行观察及照相，随机选取10个视野照相，以MAP-2阳性细胞的数目占总细胞的比例为DRGn纯度。DRG神经元胞质及轴突经MAP-2抗体免疫荧光染色后可呈现绿色荧光，而其他非神经细胞则未见绿色荧光，经复染后所有细胞的细胞核呈现蓝色荧光。本实验DRGn的纯度达(92±0.73)%，可为后续实验研究提供可靠的细胞模型。

1.4.4试验分组 根据既往研究结果分为以下4个实验分组，正常对照(Con)组、高糖(45 mmol/L葡萄糖)组(HG)、筋脉通含药血清(JMT)组、牛磺酸含药血清(Tau)组，设定45 mmol/L葡萄糖为高糖浓度，血清添加浓度均为10%。

1.4.5TUNEL法检测细胞凋亡 DRGn细胞按2×106细胞/孔的密度接种于6孔板中，更换条件培养基继续培养24 h。漂洗后用4%多聚甲醛固定样本，加入0.1%Triton X-100室温孵育。阳性对照组滴加50 μl TUNEL反应液，阴性对照组仅滴加标记液。荧光显微镜下观察，阳性细胞可见绿色荧光标记。先后滴加50 μl过氧化物酶(POD)转换剂及50 μl二氨基联苯胺(DAB)溶液，细胞核有棕黄色颗粒出现时停止反应。然后经苏木素复染，充分冲洗返蓝，镜下观察凋亡的细胞可出现特异性棕黄色颗粒。采集图片，每组随机选取10个视野，最少计数500个细胞，运用Image-ProPlus6.0图像分析软件分析图片，计算出细胞凋亡率：细胞凋亡率%=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.4.6Western印迹检测DRGn中NGF蛋白的表达 接种DRGn于6孔板中，不同条件干预24 h后细胞裂解液裂解细胞样品，提取总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度，制备SDS-PAGE电泳，每泳道加总蛋白量80 μg，进行70 V/100 V恒压电泳，经湿转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入兔抗鼠NGF多克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，加入山羊抗兔IgG(1∶3 000)室温孵育60 min，电化学发光(ECL)显色，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，分析蛋白条带，读取条带面积、宽度和灰度值,以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)的灰度比值作为目的蛋白表达的相对量，进行统计分析。

1.4.7qRT-PCR法检测DRGn中NGF mRNA的表达 接种DRGn于6孔板，分别加入不同的条件培养基培养24 h，采用Trizol一步法提取不同培养条件下的细胞总RNA，按照cDNA合成试剂盒使用说明操作，将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green I核酸染料和Line-gene荧光定量PCR检测系统进行检测，扩增循环：95℃ 2 min，95℃ 20 s(40个循环)，58℃ 20 s，72℃ 20 s。应用Primer 6.0软件设计引物，上游引物：5′-GGCATTGACTCCAAGCACTG-3′下游引物：5′-ACACGCAGGCTGTATCTATCC-3’。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，生成目的基因和管家基因的浓度结果。此样品此基因的校正后的相对含量为每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度。

1.4.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行非参数检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组细胞凋亡率比较 与Con组(28.54±8.10)%比较，HG组的细胞凋亡率显著升高〔(71.82±11.87)%，P<0.01〕；与HG组比较，JMT组〔(32.98±7.08)%〕、Tau组〔(37.51±8.53)%〕细胞凋亡率均显著降低(P<0.01)。

2.2各组NGF蛋白表达比较 与Con组比较，HG组及Tau组的NGF蛋白表达显著下降(P<0.01)，JMT组NGF蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与HG组比较，JMT组NGF蛋白的表达显著升高，而Tau组差异无统计学意义(P>0.05)；与Tau组比较，JMT组NGF蛋白表达显著升高(P<0.01)。见表1、图1。

2.3各组NGF mRNA表达比较 与Con组比较，HG组的NGF mRNA表达显著降低(P<0.05)，JMT组及Tau组NGF mRNA的表达均显著升高(P<0.01)；与HG组比较，JMT组及Tau组NGF mRNA的表达均显著升高(P<0.01)；Tau组与JMT组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图1 各组DRGn中NGF蛋白的表达

3 讨 论

研究表明〔4～6〕糖尿病周围神经病变(DPN)发生时，胰岛素作用的减弱、蛋白激酶特异性亚型的变化及神经营养因子表达的降低等多种因素均可能导致神经修复再生能力的降低。20世纪90年代，动物实验及临床研究即表明，神经营养因子的缺乏或有效性的减弱是DPN的发病原因之一〔7〕。神经营养因子是一具有神经营养活性的蛋白质，对神经元的发育成熟、神经损伤后的修复、功能的维持均有重要作用。它包含不同的种类，NGF就是其中一种对周围神经系统具有神经营养活性的蛋白质，它能够促进DRGn发育，维持其正常功能〔8〕。研究发现在背根神经节受损后很快就出现NGF水平及mRNA的变化〔9〕。在动物实验中观察到，NGF能够降低由紫杉醇诱导的胎鼠背根神经元的损伤〔10〕。在细胞实验中发现，在NGF低水平的条件下，紫杉醇可导致交感及感觉神经元轴突生长受到抑制，但提高NGF水平后，则神经元的轴突生长加速〔11〕，可见NGF在保护神经元功能及形态方面的作用。

NGF除了在维持神经元功能及形态方面的作用外，与神经细胞的凋亡还有密切联系。神经元受损后最严重的结局就是发生凋亡，凋亡也是神经元受损后难于逆转的病理基础。研究表明，神经细胞受损后发生凋亡的机制涉及众多途径，其中NGF的缺乏是其中的原因之一〔12,13〕。NGF缺乏导致细胞凋亡的机制可能包括以下方面：①NGF的缺乏可以通过NGF受体途径诱导神经元凋亡。NGF受体家族统称为酪氨酸激酶受体(Trk)，神经营养因子通过与神经元上不同亲和力的受体结合对不同的神经元有特定的营养作用。小的感觉纤维及自主神经元主要表达高亲和力的受体TrkA，还有一种低亲和力的受体p75NTR，两种受体均能调节NGF的生物学效应。研究表明，在TrkA受体表达水平降低时，NGF与大鼠血旺细胞p75NTR受体结合可激活核转录因子(NF)-κB〔14,15〕，NF-κB广泛存在于包括神经细胞在内的多种细胞中，是一个调节凋亡的重要转录因子。氧化应激、缺氧、NGF的缺乏等多种条件下均能使其表达增加〔16〕。NF-κB通过转录调节促凋亡蛋白Bcl-x 基因的表达，诱导神经元凋亡〔17〕。②高亲和力TrkA受体信号通路的激活主要是使TrkA中的酪氨酸残基Y490磷酸化，磷酸化的TrkA-Y490进一步激活其下游磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路，使NGF产生维持神经细胞存活的功能〔18〕。高糖状态下氧化应激反应增强，大量产生的活性氧簇及活性氮簇阻碍了TrkA受体磷酸化过程，使NGF的TrkA受体中的酪氨酸残基Y490发生硝基化，抑制NGF/TrkA信号转导，同时使NGF低密度受体p75NTR表达增加，通过p75NTR信号通路诱导神经元凋亡〔19〕。③Bax是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员，NGF水平的降低可导致Bax的激活，使线粒体外膜的通透性增加，细胞色素C由线粒体内膜流至胞质，在胞质内刺激形成凋亡小体，最终激活凋亡效应器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3，诱导神经元凋亡〔12〕。由此可见，NGF缺乏与神经细胞的凋亡密切相关。课题组既往研究表明，筋脉通含药血清干预50 mmol/L高糖培养的DRGn 24 h后，可以上调抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达，下调Caspase-3 mRNA及其蛋白的表达，从而减少细胞凋亡，其作用优于对照药维生素C〔20〕。此外，筋脉通含药血清还具有促进高糖培养血旺细胞的增殖，增加睫状神经营养因子(CNTF)表达的作用〔21,22〕。本实验也发现，筋脉通含药血清能够明显减少45 mmol/L高糖培养24 h DRGn细胞凋亡率，同时可增加NGF蛋白及mRNA的表达，且升高NGF蛋白表达的作用优于对照药牛磺酸。可见筋脉通含药血清能抑制DRGn的凋亡，其抗凋亡的作用可能与增加NGF的表达有关。