长链非编码RNA与乳腺癌的相关性

冯雪松 鲁明骞 陆海燕 苏 进 郭 蓉

(三峡大学第一临床医学院肿瘤防治中心 宜昌市中心人民医院肿瘤科，湖北 宜昌 443000)

乳腺癌全球发病率及死亡率分别超过20%和10%〔1〕。目前乳腺癌治疗包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗，但治疗效果有时亦不太理想。长期持续放化疗会导致一定毒副反应且降低患者抵抗力而杀伤癌细胞治疗效果也较差〔2,3〕。徐兵河〔4〕在中国肿瘤临床中对乳腺癌的靶向治疗进行了总结，主要体现在激素受体阳性乳腺癌的内分泌靶向治疗和表皮生长因子受体(HER)-2阳性乳腺癌的靶向治疗上。然而临床上使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性、早期和转移性乳腺癌，可从中获益的患者不足35%〔5〕。并且新出现的耐药问题也是亟待解决的问题。

乳腺癌组织中具有众多差异性表达的长链非编码RNA(lncRNA)，不同种类的lncRNA通过干扰mRNA的剪切，诱导细胞凋亡，X染色体沉默及基因组印记等多种方式对乳腺癌发生发展等过程产生影响〔6〕。此外，目前多种lncRNA在相应的恶性肿瘤中作为分子标志物和潜在的治疗靶点的潜能也得到了验证〔7～9〕，因此，基因组学研究将为乳腺癌的检测、诊断、治疗靶点的选择及预后情况的判断等提供了新的可行性方案。本文总结了目前国内外关于乳腺癌中差异表达并具有不同作用的lncRNA，拟为乳腺癌的早期诊断及治疗提供特异有效的靶点。

1 lncRNA概述

人类对基因组学的研究既往主要着眼于具有编码蛋白质功能的RNA，不能编码蛋白质的RNA被认为是无用RNA，称为转录噪声。然而就是这些RNA在细胞的增殖、分化、衰老和凋亡等生命活动中发挥着不可或缺的作用。其实从哺乳动物基因组学显示，仅有较少的转录本有编码蛋白质的功能，剩下的绝大部分为非编码RNA(ncRNA)，约占人类基因组80%。根据转录本的大小可以分为两大类，microRNA和lncRNA。其中长度大于200 nt的非编码RNA，称为lncRNA〔10〕。Ponting等〔11〕研究lncRNA的演变及其在转录调节、表观遗传学基因调节及疾病中的角色时推测lncRNA可能有5种不同的起源：①蛋白质编码基因序列中断产生；②通过染色质重排产生；③ 通过非编码RNA反转录转座复制产生；④含有相邻重复序列的非编码序列基因串联产生；⑤通过基因组中插入一个转座元件转录产生。然而目前关于lncRNA的起源仍没有确定的理论。对于lncRNA的生物学功能机制，主要通过信号分子、诱饵分子、引导分子、支架分子和复合分子在染色质修饰、转录水平、转录后水平及作为结构RNA在细胞增殖、分化、衰老、死亡及肿瘤的发生、发展中发挥重要调控作用〔12〕。根据其作用及在肿瘤组织中的表达模式，可分为促癌作用的lncRNA和抑癌作用的lncRNA及兼具促癌作用和抑癌作用的lncRNA。

2 lncRNA 与乳腺癌

目前研究发现与乳腺癌相关的lncRNA有以下几种：HOX反义基因间RNA(HOTAIR),H19,肺腺癌转移相关转录本(MALAT)1,类固醇受体RNA激活因子(SRA),脑胞质RNA200(BC200),LOC554202,LncRNA-ROR,JADE,应激诱导长非编码转录本(LSINCT)5,结肠相关转录因子(CCAT)2,尿路上皮癌抗原(UCA)1,生长阻滞特异转录本(GAS)5,母本印记表达基因(MEG)3,失活X染色体特异转录体(XIST),ZFAS1,转移抑制lncRNA(LIMT),阿霉素耐药相关非编码RNA(ARA)等。并且有研究发现在浸润性乳腺癌中HOTAIR和H19的表达水平比导管癌中更高；MALAT1在所有类型细胞中都高表达；而ZFAS1在所有细胞样本中均只微弱表达〔13〕。它们在乳腺癌的促癌、抑癌、侵袭、转移及药物敏感性等方面发挥重要作用，见表1。

表1 乳腺癌中常见异常lncRNA的不同作用

2.1乳腺癌中发挥促癌作用的lncRNA HOTAIR是在人成纤维细胞中被发现且以反义方式转录的lncRNA，在乳腺癌及其转移部位中均可检测到它的表达异常升高，高表达的HOTAIR会导致乳腺癌细胞的侵袭性增强，与乳腺癌的进展密切相关〔14〕，从而导致患者生存率降低及预后欠佳。而HOTAIR作为乳腺癌的预后指标，Gokmen-Polar等〔15〕认为仅适用于ER受体阴性且淋巴结转移阳性的乳腺癌患者。因此，HOTAIR作为乳腺癌预后指标的意义相对来说比较局限。当然也有不同的观点存在，Milevskiy等〔16〕在对乳腺癌相关基因表达数据分析时发现，在HER2受体丰富的肿瘤中HOTAIR与叉头框转录因子(FOX)A1和FOXM1共表达，这些因素增强了HOTAIR在侵袭性HER2阳性乳腺癌中的预后检测能力。

lncRNA H19是发现得最早的一个与肿瘤相关的lncRNA，它在某些肿瘤中既有促癌作用也有抑癌作用，但目前没有H19在乳腺癌中发挥抑癌作用的报道。多项研究均发现H19对乳腺癌的发生和发展均有重要作用，因为无论在乳腺癌原发灶还是转移灶中H19均表达增高〔17〕，高表达的H19会缩短细胞周期，加速乳腺癌细胞的增殖；并且高表达的H19与雌激素受体(ER)及孕激素受体(PR)存在关联性〔18〕，作为miR-675的前体可促进乳腺癌细胞的增殖和转移〔19〕。Sun等〔20〕研究发现H19在ER阳性乳腺癌中的表达量是在ER阴性乳腺癌中的10倍，提示H19可能是雌激素诱导基因或者与ER相互作用。H19 在乳腺癌和正常组织的差异表达为乳腺癌的诊断提供了新的生物标志物，并可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

MALAT-1于2003年通过测序和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测被发现。Miao等〔21〕研究发现，相比于正常组织，MALAT-1在80%以上的癌组织中呈现高表达，而在乳腺癌组织中高表达的MALAT-1与淋巴转移相关。如果抑制乳腺癌组织中MALAT-1的表达，则乳腺癌细胞的增殖、侵袭明显受限，并可诱导乳腺癌细胞的凋亡。并且乳腺癌患者血清中的MALAT-1水平明显高于其在良性乳腺疾病中的血清水平，且其诊断效果相当可观。Zhao等〔22〕研究发现在ER阳性的乳腺癌细胞中，使用高浓度的雌二醇(E2)治疗和单独剔除MALAT-1后发现MALAT-1表达水平显著下降，并且细胞的增殖和侵袭能力降低，表明其可能与乳腺癌的转移有关。因此，MALAT-1在乳腺癌的发生发展中扮演着重要的作用，其在血清中的水平可能成为乳腺诊断的一个新的肿瘤标记物。

SRA是在乳腺癌中高表达的lncRNA中发现得较早的一类，它可以调节类固醇受体和类固醇受体激活蛋白(SEAP)的表达水平，并与ER-α和PR等协同调控乳腺癌细胞的侵袭性〔23〕。Liu等〔24〕发现SRA相关信号通路在雌激素依耐性乳腺癌中扮演着重要角色，更多的数据显示SRA的表达水平可以作为ER阳性乳腺癌的一个新的预后指标。

BC200可作为雌激素依耐性乳腺癌的预后指标以及减低细胞增殖能力的作用靶标。Singh等〔25〕研究发现BC200在ER阳性乳腺癌中的表达水平明显高于ER阴性乳腺癌，并且敲除BC200会导致乳腺癌细胞的增殖能力明显下降。表明BC200在乳腺癌组织中的高表达有促癌作用。在侵袭性乳腺癌中BC200也是呈现出高表达的水平，表明其与乳腺癌的转移也存在相关性。

乳腺癌中还有多种lncRNA均呈现高表达，LOC554202与晚期病例分期和肿瘤大小相关，在体外敲除LOC554202会降低细胞增殖扩散的能力，抑制细胞侵袭，在体内抑制肿瘤发生〔26〕。LincRNA-ROR在三阴性乳腺癌和转移灶中高表达，通过以ADP核糖基化因子(ARF)6为靶标调节乳腺癌的侵袭性〔27〕；且其也可以和不均一核糖核蛋白相互作用抑制p53对DNA损害的反应。JADE可诱导DNA损伤反应中组蛋白H4的甲基化，异常调节参与乳腺癌的发生〔28〕。LSINCT5在乳腺癌组织中高表达，敲除LSINCT5则细胞的增殖能力下降，表明具有其促癌作用〔29〕。Cai等〔30〕通过RT-PCR发现其在乳腺癌组织中高表达，异常表达可影响Wnt信号通路，敲除CCAT2可抑制细胞的增殖和肿瘤的生长。UCA1能够促进乳腺癌细胞由上皮细胞向间叶细胞的转化，通过增强 Wnt/β连环蛋白信号通路提高乳腺癌细胞的侵袭性〔31〕。

目前发现的这些在乳腺癌中具有促癌作用的lncRNA增加了乳腺癌的患病风险，因此可通过相关的途径抑制这些lncRNA的表达从而缓解乳腺癌发生发展。但具体的作用机制仍需进一步深入研究。

2.2乳腺癌中发挥抑癌作用的lncRNA GAS5是在NIH3T3细胞中发现的，对哺乳动物细胞的生长阻滞有调控作用。其在多种不同类型的肿瘤中表达降低，研究发现其具有抑制细胞增殖、转移，诱导细胞凋亡，增强细胞对凋亡刺激物的敏感性的作用，其表达降低促进肿瘤的发生发展，包括乳腺癌〔32,33〕。并且由于GAS5表达下调多发生在乳腺癌的Ⅰ期和Ⅱ期，所以GAS5有可能成为预测乳腺癌分期的标记物之一〔34〕。这为乳腺癌的治疗提供了一种新的治疗思路，即诱导GAS5在乳腺癌中强制表达起到抑制乳腺癌的作用，目前研究发现可通过联合使用传统化学药物和双重磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)抑制剂〔35〕、干扰Notch途径〔36〕及DNA甲基转移酶抑制剂〔37〕起到强制GAS5表达的作用。

MEG3是第一个被发现有肿瘤抑制功能的lncRNA，其在乳腺癌中表达下调，通过DNA甲基化的方式抑制乳腺癌细胞的增殖。目前研究表明，MEG3还参与到p53的抑癌机制中抑制乳腺癌细胞的增殖和转移等。Sun等〔38〕研究了MEG3对乳腺癌细胞MCF7和MB231的影响，发现过表达的MEG3可以通过增强MDM2的转录水平激活p53的转录活性进而抑制细胞的增殖及转移，并发现MEG3在乳腺癌组织中表达下调可影响乳腺癌细胞的恶性生物学行为。

XIST是由失活X染色体转录产生的lncRNA，对于女性细胞的X染色体失活具有重要意义。Huang等〔39〕敲除或高表达XIST 会导致Akt磷酸化作用和细胞的生存能力相应增高和降低，进一步的研究发现在乳腺癌组织中XIST和Akt的磷酸化作用呈负相关。因此，XIST主要通过抑制Akt激活而调控细胞的生存能力，进而在乳腺癌中发挥肿瘤抑制作用。

ZFAS1在正常乳腺组织和乳腺癌组织中差异表达。Askarian-Amiri等〔40〕通过研究ZFAS1的同源基因ZFAS1在小鼠乳腺中的作用发现ZFAS1在人乳腺癌中可能是一个抑癌基因。

此外，还有一些lncRNA可以抑制乳腺癌转移从而发挥抑癌作用。HIT可调控TGF-β诱导的上皮间质转化、细胞侵袭转移过程，剔除HIT则能够抑制肿瘤细胞的生长、侵袭及转移〔41〕。BCAR4可诱导结合转录因子促使p300组蛋白乙酰化而激活非经典hedgehog/GLI2信号通路参与乳腺癌转移进程的调控〔42〕。NKILA能与NF-κB/人核因子κB抑制蛋白(IκB)结合形成稳定的复合物，抑制IKB激酶(IKK)诱导的IB磷酸化和NF-κB信号通路的活化，进而抑制乳腺癌的进展〔43〕。LIMT以前被命名为LINC01089，是一种高度保守的lncRNA，在侵袭性乳腺癌中可通过表皮细胞生长因子(EGF)及抑制其对刺激的反应抑制肿瘤的转移〔44〕。

同样的，这些抑癌作用的lncRNA可以抑制乳腺癌的增殖转移，因此，可通过不同的途径在乳腺癌中使其强制表达提高表达水平从而起到抑制乳腺癌增殖转移的作用，为临床上治疗乳腺癌提供可供选择的治疗方法及提供可用于靶向治疗的作用靶点。

2.3乳腺癌中发挥耐药作用的lncRNA ARA由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PAK)3基因内含子转录而来，在灵长类动物中含有保守、稳定的序列。通过对lncRNA行芯片分析证实ARA的表达与乳腺癌和肝癌对阿霉素的敏感性相关。在体外下调ARA的表达，可降低细胞增殖，诱导细胞凋亡，使细胞周期停留在G2/M期，并使肿瘤转移能力受限。此外，通过对转录组行芯片分析发现ARA可以参与多种促阿霉素耐药的信号通路，其中包括MAPK信号通路，新陈代谢信号通路，细胞周期与细胞黏附相关生物通路及调控细胞进程包括转录进程和蛋白质加工功能等。由此推测ARA与乳腺癌的耐药相关〔45〕。

Zhu等〔46〕通过使用阿霉素治疗抵抗的乳腺癌细胞作为模型系统研究了lncRNA H19在化疗耐药性发展中的作用和分子机制。发现H19表达在蒽环类抗生素治疗后和阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7细胞中显着增加。并且进一步研究发现明H19主要通过H19-CUL4A-ABCB1/多耐药基因(MDR)1途径在乳腺癌化疗耐药中起主导作用。此外，Si等〔47〕发现LncRNA H19通过促凋亡基因Bcl-2诱导凋亡基因(BIK)的表观遗传沉默导致ER-α阳性乳腺癌中的化学治疗抵抗。

为了研究哪种lncRNA的失调造成曲妥珠单抗耐药，Li等〔48〕通过筛选了一组涉及到曲妥珠单抗耐药细胞SKBR-3/Tr的lncRNA微阵列，发现在曲妥珠单抗治疗后的乳腺癌患者组织和SKBR-3/Tr细胞中GAS5的表达降低。提示曲妥珠单抗可减少GAS5的表达。实验发现拉帕替尼可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路上调GAS5的表达，GAS5作为miR-21的一个竞争性内源RNA(ceRNA)，竞争性结合miR-21以增加张力蛋白同源物(PTEN)促进曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞的增殖及转移。这一过程改善了乳腺癌曲妥珠单抗的治疗抵抗。最终得出结论，GAS5可改善HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗的治疗抵抗。这项工作提示GAS5可作为HER2阳性乳腺癌的新型预后指标和候选药物靶标，并提高曲妥珠单抗耐药患者的治疗效果。

综上，未来可通过不同的作用靶点改善临床上乳腺癌的治疗抵抗，从而提高乳腺癌的治疗效果。但具体的作用机制及减弱或强制其表达的机制仍有待进一步探索。这也为临床研究提供参考的额依据和方向。