一步法微滴数字PCR检 测生菜中GII型诺如病毒

陈嘉茵，方 苓，吴诗微，唐书泽，张志强，李 晖,*，吴希阳,*

（1.暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所，广东 广州 511430；3.香港中文大学生命科学学院食品及营养学部，香港）

食源性病毒疾病是一个正在受到关注的问题。在世界范围内，有大于50%的急性肠胃炎事件是由诺如病毒所造成[1]。诺如病毒是单链RNA病毒，由3 个阅读框架（OF1、OF2与OF3）组成，并根据其基因组可以分为GI～GV 5 种基因型，而GI、GII和GIV对人类有感染性，其中导致世界性诺如病毒疫情爆发的基因型为GII[2-6]。诺如病毒最早在1972年被Kapikan等[7]所检出，它具有感染剂量低、能忍受大范围温度变化等特点[8-9]。它主要传播途径为“粪—口”传播，可通过人与人之间直接传播，或接触到被污染的水和食物而进行传播[10]，常受到污染的食品有蔬菜、软质水果、贝类等[11-15]。

生菜作为饭桌上常见的生熟食均可的菜品，近年来人类为了追求健康，对蔬菜沙拉的需求增大，生吃生菜的人群逐渐增多，因受灌溉用水的洁净度与厨工的安全卫生意识水平影响，生食生菜使得人类的患病风险也在提高。2012年马来西亚爆发了第一起感染源为生菜的诺如病毒疫情[16]。2010—2015年美国疾病预防与控制中心统计数据显示，因生菜原因造成的诺如病毒疫情达到93起，患病人数共2 028 人[17]。丹麦2016年也曾因输入法国的染毒生菜导致1 个月内就有23 起诺如病毒疫情爆发[18]。

目前诺如病毒的检测方法有多种，主要分成3 部分：电镜、免疫电镜观察法，免疫学检测和核酸水平上的检测方法。其中电镜检测结果受主观因素影响较大（如电子显微镜质量，操作者熟练程度等），同时灵敏度不高，不适用于爆发性疫情的大规模检查[19]。酶联免疫吸附测定主要针对诺如病毒的蛋白质外壳进行检测，但因病毒蛋白的变异性强，导致该方法敏感性，特异性较弱[8]。核酸水平上诺如病毒的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法包括常规RT-PCR、多重RT-PCR、巢式PCR等及逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法，但RT-PCR法在电泳过程中容易出现交叉污染问题，造成假阳性结果[19]。多重RT-PCR尽管可以同时检测多种目标分子，减少反应时间，但其灵敏度较低，实验条件较为苛刻，容易出现非特异性扩增，因此RT-PCR法大多作为定性分析及判别病毒基因型用[20]。目前RT-qPCR法是检测诺如病毒的“金标准”，它具有特异性强，灵敏度较高的特点，可以对样品中的病毒数量进行较为精确的定量[21-24]。然而在RT-qPCR检测中，若样品存在PCR抑制物，则会降低其灵敏度和准确性，易造成假阴性[23,25]。同时RT-qPCR法需要依赖Ct值和标准曲线的准确性才能对样品进行定量分析，存在一定的不确定性[26]，难以检测微小的拷贝数变化，灵敏度有限也是qPCR的一个缺点[27]。鉴于诺如病毒是一种高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高对诺如病毒检测的灵敏度，建立可信的检测方法，科学评估受感染食品的安全风险是一个急需解决的问题。

微滴数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一种与qPCR不同的定量技术，相比qPCR，它有着不一样的优点。ddPCR对检测目标的定量无需标准曲线，它是通过在反应前将体系与微滴产生油混合，由微滴生成仪生成上万个液滴，每个液滴中不包含或包含一个或数个目的核酸，而每个液滴可看作一个PCR，在反应完毕后读取仪将读取液滴的荧光强度与液滴数目，根据泊松分布从而进行拷贝数定量的技术[28]。通过微滴的离散技术，它能减少样品PCR抑制物对检测的影响，从而提高了灵敏度和扩增效率，检测可达个位拷贝数，适合用于检测低浓度或抑制物含量高的样品[29-30]。

本实验建立一种快速、灵敏、准确检测生菜中GII型诺如病毒（norovirus genegroup II，NoV GII）的RT-ddPCR方法，能检测到低含量的病毒，为诺如病毒检测提供了新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶油生菜（染毒用食品材料）购自广州美思佰乐太阳新天地超市，并保存于4 ℃冰箱。

质粒制备：Primescript One step RT-PCR kit ver.2（RR055A），TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（9762），TaKaRaMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 （9761）QuickCut™ Kpn I（1618） 宝生物工程（大连）有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit（CT101-01） 北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒（DP103） 天根生化科技（北京）有限公司。

病毒洗脱：T r i s/甘氨酸/牛肉浸膏缓冲液（TGBE）：Trisbase 12 g、甘氨酸 3.8 g、牛肉膏 10 g、无RNase超纯水定容至1 000 mL，调节pH值到9.5；4×聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/NaCl溶液：PEG 8000 400 g、NaCl 69.6 g、无RNase超纯水定容至 1 000 mL；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）：Na2HPO4·12H2O 1.15 g、 KH2PO40.2 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g、无RNase超纯水定容至1 000 mL，调节pH 7.3。以上溶液均经高压灭菌。其他常规试剂均为国产分析纯。

病毒核酸提取：QIAamp viral RNA mini kit（52904）德国QIAGEN公司；RT-qPCR：One step primescript RT-PCR kit （Perfect Real Time）（RR086A） 宝生物工程（大连）有限公司；RT-ddPCR：One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes（186-4021）、RT-ddPCR Droplet Generation Oil（1863005）、RT-ddPCR Droplet Reader Oil （1863004）、Droplet Generator DG8 Cartndge （1864008）、Droplet Gene rator DG8 Gasket（1863009）、Droplet Generator Cartridge Holder（1863051）、Pierceable Foil Heat Seal（1814040）美国Bio-Rad公司；Twin.tec PCRPlate 96 德国Eppendorf公司。

1.2 仪器与设备

QX200 Droplet Digital PCR System、PX1™ PCR Plate Sealer、CFX96荧光定量PCR仪、C1000梯度PCR仪 美国Bio-Rad公司；X3FR超微量分光光度计、ST16R高速冷冻离心机 美国Thermo Scientific公司；SK-O180-Pro摇床美国Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 阳性参照样品的制备

经测序确定为NoV GII的粪便标本，加入pH 7.0的PBS制成10%的便悬液，混匀，再用PBS依次稀释至10－3并命名为高、中、低浓度（高浓度粪便样本核酸经RT-ddPCR测定值为1.70×104copies/μL，中浓度测定值为1 725 copies/μL，低浓度测定值为160 copies/μL），用于后续的食品染毒，每浓度留200 μL用于提取RNA。其中粪便标本及用于特异性检测的常见肠道病毒核酸（GI型诺如病毒、札如病毒、轮状病毒、星型病毒、腺病毒）均由广东省疾病预防控制中心微生物检验所提供。

1.3.2 引物的设计与合成

按照Loisy中NoV GII的上游引物和探针序列及Kageyama中的NoV GII下游引物合成引物探针[31-32]，该引物探针是根据GenBank上登录的Lordsdale病毒（登录号x86557）中的5 012～5 100的位置设计，上游引物QNIF2：5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’；下游引物COG2R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’；探针QNIFs：5’-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-3’，探针5’端标记荧光报告集团FAM，3’端标记荧光淬灭基团为BHQ1，上述引物和探针均由上海闪晶公司合成及标记。

1.3.3 质粒标准品的制备

利用荧光定量PCR检测的引物对提取的RNA进行RT-PCR扩增，条件为50 ℃、30 min（逆转录），94 ℃、2 min（灭活逆转录酶及激活聚合酶），94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40 次，72 ℃、10 min（灭活酶）结束，目标长度为89 bp，将扩增产物通过凝胶电泳，切胶回收后按照质粒制备试剂盒说明书进行操作。将制备成功的质粒再用质粒提取试剂盒提取，后用qPCR进行分析鉴定；将筛选的阳性重组质粒测序。测序结果在NCBI上进行BLAST分析，序列正确的阳性质粒即为NoV GII的标准品。阳性标准品用限制性内切酶Kpn I进行酶切，体系为：10 μL标准品，1 μL Kpn I酶，5 μL 10×QuickCut Buffer，用无RNase超纯水补至50 μL，37 ℃孵育6 h。取5 μL产物进行凝胶电泳分析，确认全部酶切完成后，用DNA产物回收试剂盒回收线性质粒，并用超微量分光光度计进行定量读数，计算出拷贝数后进行10 倍连续梯度稀释，于－20 ℃保存备用。

1.3.4 样品处理

食品染毒：将生菜每份25 g分装，每份生菜中加入100 μL NoV GII阳性粪便染毒液，点状涂布于菜叶表面约20 个点，并放于4 ℃干燥过夜以增加附着量，每个浓度做3 个重复，同时准备未染毒生菜样品作为阴性对照。

病毒洗脱步骤（参考ISO/TS 15216-1∶2013[31]）：将生菜切成约2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的小块，装入250 mL锥形瓶中，加入40 mL TGBE缓冲液，用锡纸盖好瓶口。室温250 r/min振荡20 min。振荡液转移至离心管，4 ℃、10 000 r/min离心30 min。将上清液转移至干净离心管中，用1 mol/L的HCl溶液调pH 7.0。加入1/3体积的4×PEG 8000/NaCl溶液，使终质量浓度达到100 g/L PEG 8000，0.3 mol/L NaCl。60 s摇匀，在4 ℃、100 r/min孵育60 min后4 ℃、10 000 r/min离心30 min。弃上清液，再4 ℃、10 000 r/min离心5 min，紧实沉淀并弃上清液。加入1 000 μL PBS进行沉淀重悬。将重悬后的悬浮液均分为2 份，其中一份加入等体积的氯仿-正丁醇溶液（1∶1，V/V），涡旋混合，室温孵育5 min，于4 ℃、10 000 r/min离心15 min。转移上层水相到新离心管中。将未经氯仿-丁醇处理的悬浮液和处理后的富集液放于－20 ℃保存准备提取RNA。

1.3.5 病毒RNA 的提取

按QIAamp viral RNA mini kit提取方法操作说明书提取RNA，置于－80 ℃保存备用。

1.3.6 RT-ddPCR体系优化

RT-ddPCR体系（20 μL）：采用One-step RT-RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂推荐的20 μL体系，以同一样品的RNA核酸，分别对引物浓度（0.2～1.0 μmol/L）、探针浓度（0.05～0.5 μmol/L）、退火温度（50～60 ℃）进行研究。根据信号读取结果判断最优体系。

1.3.7 敏感性实验

通过10 倍梯度稀释的NoV GII线性阳性质粒确定RT-ddPCR的检测范围。将连续梯度倍比稀释好的阳性质粒按照优化后的RT-ddPCR条件进行反应。使用SPSS 22.0（IBM软件公司）对RT-ddPCR的标准曲线进行线性回归分析。

1.3.8 特异性实验

用该对引物和建立的RT-ddPCR方法对NoV GII、GI型诺如病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、腺病毒进行检测，验证该方法的特异性。

1.3.9 重复性实验

为确定该反应体系的重复性，对样品进行组内（n=5）以及组间（n=3）实验。在3 周内进行检测，每周检测一次，计算组内与组间检测结果的变异系数（coefficient of variation，CV），判断该方法的重复性和稳定性。

1.3.10 人工染毒样品病毒回收率计算

利用本实验建立RT-ddPCR方法分别对从不同染毒浓度蔬菜样品处理后悬浮液所提取的病毒RNA连同用于染毒的不同浓度粪便样本（高、中、低3 个水平）提取的病毒RNA进行检测，同时将样品通过RT-qPCR进行检测，通过公式计算病毒回收率判断更适合用于食品中病毒含量检测的方法。

1.4 数据处理及图像处理

实验结果通过SPSS 22.0软件采用双因素方差分析法进行差异显著性方差分析，同时图像处理利用QX200 Droplet Digital PCR System提供的Quantasoft软件（Bio-Rad）进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 基因片段的扩增及重组质粒标准品的制备

采用RT-qPCR的上下游引物进行常规PCR，得到大约89 bp的目的片段。构建的重组质粒p-ng2标准品核苷酸测序结果经BLAST比对，显示其插入的基因片段为NoV GII.17，说明成功构建了阳性标准品。标准品酶切后，经超微量分光光度计测量浓度并换算得标准品拷贝数为8.47×109copies/μL。

2.2 RT-ddPCR条件的优化

根据软件在各浓度下检测出的核酸拷贝数，最终选用终浓度为0.9 μmol/L的引物和0.35 μmol/L探针浓度，模板添加量为2 μL。最佳循环条件：逆转录42 ℃、60 min，95 ℃、10 min灭活逆转录酶，95 ℃变性30 s，54 ℃退火及延伸1 min，45 个循环，98 ℃、10 min（灭活酶），爬坡速率为1 ℃/s。

2.3 RT-ddPCR的特异性

本实验建立RT-ddPCR方法对NoV GII有典型扩增曲线，对其他病毒均无扩增，表明这对引物在这RT-ddPCR方法上特异性良好（图1）。

图1 RT-ddPCR NoV GII特异性实验Fig. 1 Specificity of RT-ddPCR for NoV GII

2.4 RT-ddPCR的敏感性实验

R T-d d P C R对低浓度的阳性质粒p-n g 2有扩增，最低检测限为2.12 copies/μL，最高检测限为8.47×104copies/μL，浓度过高时液滴全部为阳性（8.47×105、8.47×106copies/μL），说明超过检测上限（图2）。将连续梯度稀释好的阳性标准品进行RT-ddPCR分析，RT-ddPCR标准曲线的R2值为0.997 3，扩增效率为95.44%，表明RT-ddPCR具有良好的线性关系。

图2 RT-ddPCR检测NoV GII敏感性实验Fig. 2 Sensitivity of RT-ddPCR for NoV GII

2.5 RT-ddPCR的重复性实验

表1 一步法微滴数字RT-PCR检测NoV GII重复性分析Table 1 Repeatability analysis of one-step RT-ddPCR detection of NoV GII

如表1所示，3 周内组内CV均小于4%，组间CV结果为1.75%，说明本方法具有良好的重复性。

2.6 RT-ddPCR和RT-qPCR回收率计算结果

将样品中提取的病毒RNA及各浓度染毒用粪便稀释液中提取的病毒 RNA通过RT-ddPCR和RT-qPCR进行分析，计算病毒回收率，结果见表2。

表2 RT-qPCR与RT-ddPCR对不同染毒浓度和方法 回收率计算结果对比Table 2 Mean percentage recovery calculated for three inoculum levels of NoV GII detected by quantitative PCR and RT-ddPCR%

根据不同染毒浓度和处理办法在两种检测仪器上得出的回收率数据在SPSS 22.0软件中采用双因素方差分析法进行Tukey差异显著性方差分析，表2表明高、中浓度下，4 种检测方法没有显著性差异。低浓度下，未经氯仿处理的qPCR结果与另外3 种方法均存在显著性差异（低浓度下方法1平均回收率仅1.43%，方法2平均回收率为9.71%，方法3平均回收率为11.80%，方法4平均回收率为12.53%，P＜0.05）。而各种浓度下，方法2、方法3、方法4之间没有显著性差异。

3 讨论与结论

现有的RT-qPCR技术检测NoV GII等食源性肠道病毒存在因样品染毒浓度低，经富集后仍难以检测出的问题，反映出RT-qPCR灵敏度的局限性。同时也存在检测过程中受抑制物影响而导致无法检测的情况[25]。虽然RT-qPCR法具有步骤简便节省时间等好处，但其自身因需要标准品制定标准曲线去判定样品中目标基因的数量，容易因时间地点和抑制物的原因而导致结果的偏差[25]。本研究将检测NoV GII的RT-qPCR引物探针运用到RT-ddPCR上，其扩增效率超过95%及良好的线性关系表明RT-ddPCR具有定量检测实际样品的潜力。它通过将反应体系微滴化，再利用终点检测的方法，尽量减少了抑制物对反应体系的影响，能有效检测低浓度的病毒量。本研究显示RT-ddPCR最低检测限为2.12 copies/μL，并且检测方法显示出了良好的重复性。

尽管病毒在蔬菜中不能繁殖，但如何从蔬菜样品中有效富集和洗脱病毒，减少抑制物带来的影响，提取出高纯度的RNA，对后续的样品检测是不可或缺的。在ISO/TS 15216-1∶2013标准中，食品中诺如病毒RNA的提取方法里蔬菜不用像软质水果经过氯仿-丁醇的去抑制物处理，猜测是因为相比较软质水果等容易在处理过程中释放糖分果胶等PCR抑制物，而蔬菜中释放的该类抑制物较少[23]。为去除生菜中可能含有的PCR抑制物，本实验将悬浮沉淀后得到的悬浮液分为两份并对其中一份进行氯仿-丁醇处理以对比处理前后抑制物对RT-qPCR与RT-ddPCR的影响。通过本实验结果显示，随着病毒数量的减少，蔬菜中的叶酸、色素等抑制物百分比含量上升，利用氯仿-丁醇去除抑制物的步骤显得愈发重要，对比RT-qPCR与RT-ddPCR的回收率结果可以发现，RT-ddPCR在存在抑制物的影响下，检测结果与去除抑制物后的回收率相差不大，没有显著性差异，且较低浓度下检测结果均值比去除抑制物后的RT-qPCR结果要高，说明RT-ddPCR能有效抵抗PCR抑制物对反应的影响，能代替RT-qPCR进行日常食品样品的检测，且可以省略使用氯仿-丁醇去抑制物的步骤，节省时间同时有利于环境保护。

本实验针对诺如病毒疫情爆发的元凶主要为NoV GII[2-6]，且蔬菜作为其病毒的有效载体的情况成功建立了一步法RT-ddPCR检测蔬菜中NoV GII的方法。该方法特异性良好，避免了两步法中可能出现的污染，节省了时间，同时测定了该方法的最低检测限达到个位拷贝数，具有极高的灵敏度，为食品中诺如病毒量小难以检测这一难题提供了可行的解决方法，更切实地保障了食品安全性。