中链甘油三酯/玉米醇溶蛋白核壳结构微胶囊载体的构建及表征

黄 雪，王 颖，张 慧，赵 萌,2,*，方亚鹏,2

（1.湖北工业大学 菲利普斯亲水胶体研究中心，湖北省食品胶体国际科技合作基地，湖北 武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

核壳结构是一种较为理想的微胶囊载体形式，质地坚硬，对消化液、水分等具有较低的渗透性，可减少外界因素对包埋物的伤害，有利于包埋物的保护和贮存，文献中常见的核壳结构体系有海藻酸钠/壳聚糖[1-3]、海藻酸钠/聚乙烯醇[4]、聚环氧乙烷/壳聚糖[5]、葡聚糖/β-伴大豆球蛋白[6]、聚丙烯酸酯/环氧改性聚氨酯等[7-8]。玉米醇溶蛋白（Zein）是一种强疏水性蛋白，溶于高体积分数乙醇水溶液、不溶于水[9-11]。在70%乙醇溶液中，Zein的α-螺旋结构含量在50%～60%左右，随着乙醇体积分数的降低，α-螺旋逐步转变为β-折叠，在疏水作用下反向排列、形成长带状结构，进而卷曲成圆盘层状结构，最终自组装成纳米、微米颗粒结构[12-13]。依据这一特性，可采用反溶剂法荷载活性成分，即将溶于高体积分数乙醇的Zein/活性组分混合物，加入水溶液中，高速剪切，形成水不溶性颗粒[14]。目前，该法包埋的活性成分有鱼油[15]、精油[16-17]、亚麻油[18]、槲皮素[19-20]、柚皮素[21]、番茄红素[22]以及溶菌酶[23]等。该法制备的活性颗粒多为纳米级，存在荷载组分种类有限、收集困难、荷载量小等问题[21,24]。Filippidi等[25]报道中链甘油三酯（mediumchain triglyceride，MCT）/Zein核壳结构微胶囊的反溶剂制备法，分别以MCT和60%乙醇的Zein溶液为油相和水相，高速剪切制备O/W乳液，缓慢加水，通过Zein在油滴表面凝聚而形成微胶囊，最后旋蒸、去除多余乙醇。该核壳结构微胶囊的粒径大小为20～100 μm，壁厚为（4.0±0.7）μm，在模拟胃液和胆盐中可保持较为完整的结构，抑制了脂肪水解速率。

Filippidi等[25]的Zein反溶剂法制备活性组分微胶囊，一定程度上改善了荷载组分种类有限、收集困难、荷载量小等问题，但仍比较局限，特别是需要旋蒸浓缩收集微胶囊，大大影响了包埋物活性及挥发性包埋物包埋率。本研究通过降低剪切速率增大微胶囊尺寸，在Zein向油滴沉淀的过程中，向水相中添加阿拉伯胶（gum arabic，GA），通过GA和Zein的相互作用[26-27]，降低微胶囊的成团和挂壁现象，后通过离心收集MCT/Zein微米微胶囊。本实验中微胶囊制备方法简单易行，特别是离心收集避免了旋蒸对包埋物的不利影响，适用于多种油溶性活性组分的包埋和保护。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白 北京百灵威科技有限公司；中链甘油三酯 马来西亚KLK公司；GA 日本San-Ei Gen公司；无水乙醇、吐温80 国药集团化学试剂有限公司；尼罗蓝A 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Mastersizer 2000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；BT-1600百特图像颗粒分布仪分析系统 日本电子株式会社；Direct Q3型超纯水机 美国默克密理博公司；EL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BT100LC恒流泵 保定创锐泵业有限公司；机械搅拌器 德国IKA公司；DF-101S集热式磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；FV12000MPE激光共聚焦显微镜 日本Olympus公司；JSM6390LV扫描电镜 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 MCT/Zein微胶囊载体的制备

反溶剂法制备MCT/Zein核壳结构微胶囊主要参照文献[25]的方法，并在此基础上有所改进：1）配制100 mL体积分数为60%的乙醇溶液，添加一定量的乳化剂；2）将Zein加入到该乙醇溶液中，室温条件下300 r/min搅拌30 min至完全溶解，配制成质量浓度4 g/100 mL的Zein溶液；3）向100 mL质量浓度4 g/100 mL的Zein溶液中加入5 mL MCT；4）37 ℃水浴，在一定速率下机械搅拌5 min形成乳液；5）保持转速300 r/min，用恒流泵以一定速率滴加定量水相，使Zein沉积；6）室温静置后离心收集下层沉淀，即得到微胶囊载体，冷冻干燥后得到冻干粉。通过扫描电镜和激光共聚焦以及冻干后样品重悬的粒径分布考察微胶囊载体的稳定性。在实验优化过程中，采用单一因子变量法，控制其他条件不变，改变乳化剂类型（无乳化剂、吐温80、GA）、乳化剂质量分数（体积分数60%的乙醇溶液为基准的0%、0.25%、0.5%、1%质量分数的GA）、乳化速率（300、500、800 r/min）、Zein沉淀溶液（130 mL水、100 mL水＋30 mL GA溶液、70 mL水＋60 mL GA溶液、30 mL水＋100 mL GA溶液，其中GA质量分数为1%）、Zein沉淀溶液加入速率（3、6、9、12 mL/min），研究不同实验条件对MCT/Zein微胶囊载体形态的影响。

1.3.2 宏观形态观察

分别从3 个角度对样品进行拍照：样品制备，静置1 h，1）对静置沉积的MCT/Zein微胶囊载体混合物侧面进行拍照，记为体系侧面图；2）俯视角度，对微胶囊载体混合物的表面出油情况进行拍照，记为体系上方图；3）倾倒出上清液，俯视角度对底部收集的MCT/Zein微胶囊载体进行拍照，记为沉淀上方图。通过体系侧面图和体系上方图判断样品包埋出油情况，通过沉淀上方图直观表示微胶囊整体外观情况。

1.3.3 光学显微镜观察

采用BT-1600图像颗粒分析系统监测微胶囊载体形态。取少量湿态微胶囊载体滴加于载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察并拍照。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

将导电胶贴在样品台表面，将少量冻干后的样品粉末平铺在导电胶上，吹去多余的粉末，通过喷金处理增加样品导电性，以10 kV的加速电压，在调节样品和探头的距离后使用扫描电子显微镜在200 倍和1 000 倍条件下进行观察。

1.3.5 激光共聚焦显微镜观察

将冻干粉重悬水溶液中混匀，加入尼罗蓝染色液（质量分数1%的溶液），充分混合后置于背光处染色。将染色后的微胶囊载体滴在载玻片上，盖上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜下观察。对尼罗蓝分别采用488 nm和633 nm的激发线以及500～600 nm和640～750 nm的发射带通，在488 nm激发线下检测油相，在633 nm激发线下检测蛋白质，获取样品的共聚焦显微镜图像。

1.3.6 粒径分布测定

粒径分布通过Marstersizer 2000激光粒度仪测定。将待测样品等效为一个球体，根据大颗粒散射角小，小颗粒散射角大的激光衍射基本原理，设置多个角度的检测器，通过检测器检测到的散射光的光强大小计算粒径大小及分布。使用超纯水作为分散剂，其折光率为1.33，将样品折射率设定为1.52，吸收率为0.1，泵转速为2 000 r/min，将微胶囊载体溶液逐滴加入分散剂中，通过Hydro 2000MU型湿法进样器进样进行测定。微胶囊载体的粒径分布以颗粒粒径的对数坐标为横坐标，该粒径下的颗粒所占体积分数为纵坐标所绘制。微胶囊载体的平均粒径用D[4,3]表示，代表体积加权平均值，粒径分布宽度用Span表示，当Span为1时，粒径分布呈对称分布。

1.4 数据处理与分析

实验数据用Excel软件进行分析。微米载体的共聚焦显微镜图像使用Olympus图像软件处理，合并两种不同激发线下的共聚焦显微镜图像而成。

2 结果与分析

2.1 乳化剂类型对微胶囊载体形态的影响

乳化剂类型对MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态的影响结果见图1。由图1a1～c1可知，3 组样品宏观出油情况差异不大；但在微观形态图1a2～c2中，乳化剂为GA的微胶囊形态较好且油脂包埋均匀，当乳化剂为吐温80和不使用乳化剂时，微胶囊形态较差、不能完整包埋油。另外，由图2的粒径分布也可看出，乳化剂为GA时，颗粒呈单峰分布，尺寸均一。因而，以GA为乳化剂制备油/Zein微胶囊载体效果最好。

在MCT/Zein微胶囊载体制备过程中，GA乳化效果远高于吐温80。主要是因为GA是大分子乳化剂，为带负电多糖，和Zein具有一定的静电作用及空间位阻稳定作用，能防止油/Zein颗粒的聚集粘壁现象。Chen Huaiqiong等[28]发现GA可以稳定Zein的纳米颗粒，在pH 3.0～8.0范围内能阻止Zein颗粒的聚集，作用机理为静电和疏水相互作用促使GA在Zein表面的吸附。因此，选择GA作为乳化剂进行后续实验。

图1 不同乳化剂制备的MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态Fig. 1 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules preared with different emulsifiers

图2 不同乳化剂制备的MCT/Zein微胶囊载体的粒径分布Fig. 2 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsifiers

2.2 乳化剂质量分数对微胶囊载体形态的影响

由图3a1～d1右上图可知，a1～c1组样品宏观出油情况差异不大，但d1组样品表面出油严重，表明在该质量分数下油相未被完全包埋；由a1～d1右下图可以看出，b1～d1组收集的微胶囊无明显差异，但a1组微胶囊明显出油，说明在该质量分数下微胶囊间存在聚集现象，导致表面出油；在微观形态图3a2～d2中也可以看出：GA质量分数在0%和0.25%时，呈现为明显的多核结构，微胶囊间聚集造成样品出油；1% GA时，微胶囊尺寸过小；0.5% GA时，微胶囊形态较好且油滴包埋均匀。图4的粒径分布也表明，0.5% GA时，微胶囊呈单峰分布，尺寸均一。因此，0.5% GA时制备的MCT/Zein微胶囊载体效果最好。

乳化剂质量分数过高或过低均不利于MCT/Zein微胶囊载体的制备。当GA质量分数较低时，乳化能力不足，不能完全稳定油相，导致乳化后油滴进一步聚集，形成多核、大尺寸结构，而当GA质量分数过高时，GA和Zein之间相互作用增强，GA和油滴之间发生竞争作用，导致大部分油滴没有被Zein完整沉积包埋。因而，选择0.5%GA为乳化剂进行后续实验。

图3 不同GA质量分数下的MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态Fig. 3 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules with different GA concentrations

图4 不同GA质量分数下的MCT/Zein微胶囊载体粒径分布Fig. 4 Size distribution pro files of MCT/zein microcapsules with different GA concentrations

2.3 乳化速率对微胶囊载体形态的影响

在制备MCT/Zein微胶囊载体过程中，乳化速率作为关键因素不仅会影响微胶囊的形态和粒径，对于微胶囊的稳定性也有一定的影响。一般来说，乳化速率越大，微胶囊粒径越小，越趋于稳定。考虑到乳化速率对微胶囊尺寸和包埋物活性的影响，本实验在300～800 r/min范围内进行优化。由图5a1～c1可知，低乳化速率（300、500 r/min）条件下，样品宏观出油情况严重，800 r/min的乳化速率可使微胶囊有效包埋油脂。由微观形态和粒径分布表明，3 组样品形态和粒径差异不大（图5a2～c2、图6）。前期实验中，当乳化速率为300 r/min时，不论采用何种乳化剂，所制备的样品均出油严重，因而，乳化速率在包埋油相的过程中尤为重要。在控制微胶囊尺寸的条件下，考虑到800 r/min能够增强油滴的稳定性，且对大多活性组分损伤较小，故选择乳化速率为800 r/min进行后续实验。

图5 不同乳化速率下的MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态Fig. 5 Macro-morphology and micro-morphology of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsification speeds

图6 不同乳化速率制备的MCT/Zein微胶囊载体的粒径分布Fig. 6 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different emulsification speeds

2.4 Zein沉淀溶液对微胶囊载体形态的影响

图7 不同Zein沉淀溶液制备的MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态Fig. 7 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules prepared with different zein precipitation solutions

本实验制备的微胶囊尺寸较大，极易聚集，在前期实验中，采用单纯加水沉积Zein会使微胶囊聚集成团且挂壁严重。文献报道，阴离子多糖甜菜果胶可通过静电作用和空间位阻作用稳定Zein胶体颗粒[29]，在薄荷油/Zein纳米微胶囊中加入GA溶液也具有很好的稳定效果[28]。因而，本实验采用同时加水和加分散稳定剂GA溶液的方式来沉积Zein，并稳定MCT/Zein微胶囊载体。图7为不同Zein沉淀溶液对MCT/zein微胶囊载体的宏观形态和微观形态的影响：图7c1和图7c2显示“30 mL水＋100 mL GA溶液”的沉淀溶液对油脂宏观包埋效果最好且微胶囊表面没有出油现象，微胶囊微观形态较好且大小均一；其他加水方式均存在油脂包埋效果差、出油等问题。图8同样可以看出，沉淀溶液“30 mL水＋100 mL GA溶液”的微胶囊载体粒径跨越系数最小，粒径最为均一。

图8 不同Zein沉淀溶液制备的MCT/Zein微胶囊载体的粒径分布Fig. 8 Size distribution of MCT/zein microcapsules prepared with different zein precipitation solutions

当沉淀溶液为“130 mL水”和“60 mL水＋70 mL GA溶液”时，微胶囊呈现多核结构主要是因为在Zein沉积过程中稳定剂不足导致油滴部分聚集在一起；当沉淀溶液为“130 mL GA溶液”时，GA和Zein之间相互作用明显增强，GA的竞争作用使得Zein不能很好地包埋油滴；当沉淀溶液为“30 mL水＋100 mL GA溶液”时，适量的稳定剂在不影响油滴包埋效果下很好地防止了油滴聚集。综上所述，选择Zein沉淀溶液为“30 mL水＋100 mL GA溶液”进行后续实验。

2.5 Zein沉淀溶液加入速率对微胶囊载体形态的影响

图9 Zein沉淀溶液不同加入速率下制备的MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态Fig. 9 Macro-morphological and micro-morphological features of MCT/zein microcapsules prepared at different addition rates of zein precipitation solution

图10 Zein沉淀溶液不同加入速率制备的MCT/Zein微胶囊载体的粒径分布Fig. 10 Size distribution profiles of MCT/zein microcapsules prepared at different addition rates of zein precipitation solution

在MCT/Zein微胶囊载体制备过程中，Zein沉淀溶液加入速率明显影响微胶囊的粒径。Filippidi等[25]采用缓慢加水的方法，制备了20～100 μm的微胶囊颗粒。本实验以微胶囊宏观形态、微观形态和粒径分布特性为指标，优化Zein沉淀溶液加入速率。溶液加入速率对MCT/Zein微胶囊载体宏观形态和微观形态的影响（图9）表明，Zein沉淀溶液加入速率并没有造成样品的宏观形态和微观形态的显著差异；由图10可以看出，当加入速率为3 mL/min和6 mL/min时，微胶囊均呈现为单峰分布，粒径分布较窄，当加入速率为9 mL/min和12 mL/min时，微胶囊呈现为多峰分布，分布略宽。实验结果表明，随着沉淀溶液加入速率的增大，微胶囊粒径分布变广，大小不再均一，这可能是由于加入速率的增加，Zein不仅在油滴表面沉积，其本身在水相也会沉积，从而使得微胶囊呈现出多峰分布。综合考虑制备时间长短和微胶囊粒径形态，选择Zein沉淀溶液加入速率为6 mL/min进行后续实验。

2.6 MCT/Zein微胶囊载体的制备及表征

图11a、b显示MCT/Zein微胶囊载体具有良好的核壳结构，冻干后微胶囊核壳结构保持完好、未塌陷。经尼罗蓝染色，MCT/Zein微胶囊载体的油相和蛋白相在CLSM下呈绿色和红色，两者颜色叠加后显示为橙色；由图11c可以看出，Zein分布在核壳结构微胶囊的表面，将油滴很好地包埋在微胶囊中。图12为微胶囊冻干后重悬的粒径分布图，MCT/Zein微胶囊载体冻干重悬后的平均粒径为（49.86±2.27）μm，粒径跨越系数为1.032±0.01。另外，需要说明的是，MCT/Zein微胶囊载体贮藏稳定性好，低温贮藏30 d，没有表面出油现象。

图11 冻干MCT/Zein微胶囊载体的扫描电镜图（a、b）和激光共聚焦图（c）Fig. 11 SEM (a and b) and CLSM observation (c) of freeze dried MCT/zein microcapsules

图12 冻干MCT/Zein微胶囊载体的粒径分布Fig. 12 Size distribution profiles of freeze dried MCT/zein microcapsules

综上所述，MCT/Zein微胶囊载体冻干复溶后核壳结构依旧保持较好的形态，且粒径均一，具有良好的复溶稳定性和贮藏稳定性。扫描电镜图和激光共聚焦图显示出微胶囊呈多核结构，即Zein并不是均匀沉积在MCT油滴表面，这可能是Zein包裹小粒径油滴后又再次沉积在较大油滴表面。Filippidi等[25]制备的MCT/Zein微胶囊为单核的核壳结构，这主要是制备方法不同造成的。Filippidi等[25]采用4 500 r/min的乳化速率，以旋蒸方式促进乙醇快速挥发，Zein在油滴表面均匀析出，形成了较好的单核结构；而本法中乳化速率较小，且在沉积过程中采用缓慢加水和GA溶液的方式沉积Zein，并未旋蒸，因此造成MCT/Zein微胶囊在结构上存在较大差异。

3 结 论

本实验采用水相反溶剂法成功构建了MCT/Zein微胶囊载体的核壳结构，通过考察微胶囊载体宏观、微观形态以及粒径大小与分布情况，对MCT/Zein微胶囊载体的制备工艺进行优化，当乳化剂为0.5% GA、乳化速率800 r/min、Zein沉淀溶液为“30 mL水＋100 mL GA溶液”、Zein沉淀溶液加入速率6 mL/min时，成功制备出了粒径均一、稳定性良好、具有典型核壳结构的MCT/Zein微胶囊载体。本制备方法的优点为：1）简单易行；2）油相选择性多，如MCT、植物油、动物油、脂肪酸等；3）适用于多种油溶性活性组分的包埋和保护研究：金枪鱼油、蓝蓟油等动物性油组分，香草油、薄荷油、薰衣草油等精油组分，姜黄素、虾青素、番茄红素等油溶性色素组分，VA、VD2、VE等脂溶性维生素组分。另外，制备过程中所用组分均为天然高分子，符合食品微胶囊“天然绿色”的发展趋势。