去折叠态β-乳球蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯的相互作用

付珊琳，钟俊桢*，姚文俊，覃芳芳，刘成梅，刘 伟

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛奶乳清中一种主要的蛋白质，含量占牛乳乳清中蛋白总量的50%。β-LG是分子质量约为18.4 kDa的水溶性耐热球状蛋白质。它由162 个氨基酸残基组成，通过8 股反向平行的β-折叠链构成一个β桶（即“calyx”）[1]。β-LG在酸性条件下稳定，在碱性环境相对不太稳定。β-LG作为脂质运载蛋白家族的一员，其重要的理化性质是可以在体外结合多种配体，比如β-胡萝卜素[2]、姜黄素[3]、亚油酸[4]、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）[5]、大蒜素[6]等。

天然多酚类物质在植物界中广泛存在，是一种优良的天然抗氧化剂。大量研究表明，多酚类物质具有抑菌、增强免疫力、降血脂、预防动脉硬化等作用[7]。茶多酚就是其中之一，可作为安全的添加剂在食品中广泛应用。儿茶素是茶多酚中的主要物质，约为茶多酚总量的70%。其中EGCG是儿茶素中含量最高的多酚，占儿茶素总量的50%左右，是儿茶素抗氧化性的最主要的贡献者[8]。EGCG在食品体系中，能与食品中的蛋白质发生相互作用。Wu Xuli等[9]研究表明，β-LG与EGCG结合后，其与IgE多克隆抗体和IgG多克隆抗体结合能力有所降低，致敏性下降。Li Zheng等[10]研究显示EGCG能与牛血清蛋白形成纳米颗粒，改善EGCG的吸收。研究EGCG与蛋白质的相互作用有助于了解EGCG与蛋白质在食品中的真实状态和它们之间的相互影响。

β-LG的功能性质很容易被热、高压、酶解等处理改变。其与配体的结合也依赖于与pH值、温度等环境因素相关的蛋白质的结构和聚合状态。Zorilla等[11]研究表明，热处理的β-LG比天然β-LG与配体的结合常数更大，且对配体的保护效果更好，而这可能是由于热处理使得β-LG去折叠导致的。但目前关于去折叠态β-LG（unfolded-β-LG，U-β-LG）与EGCG相互作用的研究还较少。Gomaa等[12]研究表明，相同温度条件下，β-LG经微波处理能达到比加热更好的去折叠效果。因此，本研究参考Gomaa等[12]的方法利用微波处理制备U-β-LG，并采用荧光光谱、紫外-可见光谱、圆二色光谱的光谱学方法研究U-β-LG与EGCG的相互作用机制，与天然β-LG相比较，考察U-β-LG与EGCG相互作用的差异，探究不同构象条件下β-LG与多酚相互作用的机制变化，为改性蛋白与多酚类物质自组结合机制研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛β-L G（纯度≥9 0%）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美国Sigma公司；EGCG（纯度≥98%） 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

NJL07-3型实验专用微波炉 南京杰全微波设备有限公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司；UV-16000PC紫外光谱仪 上海美谱达仪器有限公司；FiveEasy Plus pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MOS-450光谱仪器 法国French Bio-Logic SAS 公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 6.8）分别配制质量浓度为5 mg/mL的β-LG溶液储备液和50 mg/mL的β-LG溶液，其中质量浓度为50 mg/mL的β-LG溶液用于制备样品。用0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 6.8）配制浓度为2 mmol/L的EGCG储备溶液，现用现配。

1.3.2 U-β-LG的制备

参考文献[12]，采用15～300 W之间的微波使β-LG溶液温度在5 min之内达到80 ℃，并处理10 次。每次结束后立即放入冷水浴中冷却到4 ℃。在微波处理后立即测量溶液温度。制得的样品即为U-β-LG。样品置于4 ℃条件下保存。

1.3.3 荧光光谱测定

用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG与EGCG的物质的量比为1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合溶液。最终反应体系中β-LG或U-β-LG浓度为10 µmol/L。将装有混合溶液的离心管分别置于288 K水浴反应1 h后取出，用荧光分光光度计在与水浴相同温度条件下检测荧光强度大小的变化。将配制好的样品取少量用于润洗标准石英比色皿，取2 mL样品于比色皿中进行荧光扫描。荧光分光光度计激发波长为280 nm，扫描发射光谱范围为290～450 nm。激发和发射的狭缝宽度均为5.0 nm，扫描速率1 200 nm/min。在同样条件下扫描在298 K和308 K条件下反应的荧光光谱。

1.3.4 紫外吸收光谱分析

用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG与EGCG的物质的量比为1∶0、1∶5、1∶10的混合溶液。最终反应体系中的β-LG或U-β-LG的质量浓度为0.1 mg/mL。用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.8）配制浓度为10 µmol/L的EGCG溶液。将装有β-LG或U-β-LG的混合溶液和EGCG溶液的离心管分别置于298 K水浴静置1 h后取出。装有β-LG或U-β-LG的混合溶液的紫外吸收光谱波长扫描范围为200～360 nm，EGCG溶液的紫外吸收光谱波长扫描范围为290～450 nm，光径为1 cm，光谱带宽为2.0 nm，响应时间为0.2 s，波长间隔为1.0 nm，测定温度为298 K。

1.3.5 远紫外圆二色光谱

用0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 6.8）将样品稀释为蛋白质量浓度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG与EGCG的物质的量比为1∶0、1∶5、1∶10。将装有β-LG或U-β-LG的混合溶液的离心管分别置于298 K水浴静置1 h后取出。配制好的样品取适量润洗标准石英比色皿，取1 mL样品于比色皿，使用MOS-450光谱仪器用于远紫外圆二色光谱分析。采用光路长为0.1 cm的圆形石英比色皿，扫描范围为190～250 nm，扫描步进分辨率为1 nm，扫描速率为100 nm/min，谱带宽度为2.0 nm，测定温度为298 K。每份样品重复扫描3 次，采用DichroWeb在线数据库预测二级结构相对含量。

1.3.6 外源性荧光测定

采用ANS荧光探针法测定蛋白质的表面疏水性。用0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 6.8）将样品稀释为蛋白质量浓度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG与EGCG的物质的量比为1∶0、1∶5、1∶10。将装有β-LG或U-β-LG的混合溶液的离心管分别置于298 K水浴静置1 h后取出。分别取4 mL样品与20 µL溶于0.01 mol/L的磷酸缓冲溶液（pH 6.8）的8 mmol/L的ANS溶液混合，涡旋振荡30 s，避光静置3 min后取2 mL用于测定荧光强度。激发波长370 nm，发射波长400～600 nm，扫描速率1 200 nm/min，激发和发射的狭缝宽度均为10 nm，测定温度为298 K。

1.4 数据处理

采用SPSS 24.0软件在对实验数据进行单因素方差分析（ANOVA），显著性水平设定为0.05。所有实验均重复3 组，蛋白质二级结构相对含量数据表示为。采用Origin 7.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 EGCG对β-LG和U-β-LG荧光光谱的影响

酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等发色基团是使蛋白质具有内源性荧光特性的主要基团。β-LG含有2 个色氨酸残基（Trp19和Trp61）和4 个酪氨酸残基（Tyr20、Tyr42、Tyr99和Tyr102），是研究β-LG内源性荧光变化的主要工具。从图1可以看出，在298 K时，β-LG和U-β-LG的最大荧光发射波长（λmax）分别为334 nm和338 nm，并随着EGCG浓度的增加β-LG和U-β-LG的λmax均有轻微的红移，荧光强度减小。这说明EGCG能与β-LG或U-β-LG相互结合，并且使β-LG和U-β-LG的结构发生变化，色氨酸和酪氨酸的极性增强，疏水性下降[13]。U-β-LG荧光强度大于β-LG的荧光强度可能是由于微波处理使得β-LG发生去折叠[12]。在EGCG浓度为100 µmol/L时，β-LG和U-β-LG的内源性荧光强度分别降低了83.29%和89.56%。这说明EGCG对U-β-LG的猝灭能力比对β-LG的猝灭能力强。这可能是由于EGCG与U-β-LG的相互作用能力更强[14]。

图1 在不同EGCG浓度条件下测定的β-LG（A）和U-β-LG（B）荧光光谱Fig. 1 Fluorescence spectra of β-LG (A) and U-β-LG (B) at different concentrations of EGCG

2.2 荧光猝灭机制

荧光猝灭可能在不同的机制下发生，一般可分为静态和动态猝灭。静态猝灭时，随着温度升高，复合物稳定性会下降，猝灭常数降低。而动态猝灭是由于猝灭剂分子的扩散和碰撞导致，随着温度升高，猝灭常数会增大。在288、298 K和308 K条件下，β-LG和U-β-LG与EGCG之间的猝灭效率可通过Stern-Volmer方程[15]（1）分析：

式中：F0为没有淬灭剂（EGCG）存在条件下的荧光强度；F为淬灭剂（EGCG）存在时的荧光强度；Kq为双分子淬灭过程的速率常数/（L/（mol·s））；τ0为淬灭剂不存在时的荧光分子的平均荧光寿命/s；Ksv为动态淬灭常数/（L/mol）；[Q]为淬灭剂浓度/（mol/L）。

图2 不同温度条件下β-LG（A）和U-β-LG（B）与EGCG相互作用的Stern-Volmer曲线Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-LG (A) and U-β-LG (B)by EGCG at different temperatures (pH 6.8)

表1 不同温度条件下的EGCG与β-LG和U-β-LG的猝灭常数、结合常数和热力学参数Table 1 Quenching and binding constants and thermodynamic parameters for interactions between β-LG or U-β-LG and EGCG at different temperatures

根据Stern-Volmer方程（1），以F0/F为纵坐标，Q为横坐标作图，如图2所示。β-LG和U-β-LG的Stern-Volmer曲线均为非直线关系。这说明EGCG对β-LG和U-β-LG的内源荧光的猝灭都不是主要由动态猝灭导致的，而可能是因为EGCG与β-LG和U-β-LG之间形成不发光的复合物或者动态和静态猝灭共同导致的[16-17]。如表1所示，β-LG的Ksv随着温度的升高而增大，U-β-LG的Ksv随着温度的升高先减小后增大。所以可能是在猝灭过程中最初是动态猝灭，但是静态猝灭也可能存在于EGCG和β-LG或U-β-LG的体系中[18-19]。由于β-LG和U-β-LG的Kq显然均大于扩散和碰撞导致的猝灭的最大扩散猝灭常数（2×1010L/（mol·s）），所以EGCG对β-LG和U-β-LG的猝灭机制主要是静态猝灭[20]。

2.3 紫外-可见吸收光谱分析

紫外-可见吸收光谱法是一种检测结构变化和测定复合物形成的简单有效的方法[21]。通常，最强吸收峰（约214 nm）反映的是蛋白质分子的肽链，弱吸收峰（约280 nm）主要是包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在内的芳香族氨基酸的吸收峰[22]。为进一步判断EGCG对β-LG和U-β-LG的猝灭方式，测定EGCG与β-LG和U-β-LG的物质的量比为0∶1，5∶1，10∶1时的紫外吸收光谱。从图3可以看出，β-LG和U-β-LG分别与EGCG结合前后的吸收光谱并没有发生重叠，形成了新的紫外光谱。随着EGCG浓度的增加，在β-LG和U-β-LG的最大吸收波长处吸收强度降低，最大吸收波长红移，位于278 nm波长处的吸收强度也随着EGCG浓度的增加而增大。这表明EGCG分别与β-LG和U-β-LG发生相互作用，引起蛋白质结构变化，形成复合物[22]。并进一步说明EGCG对β-LG和U-β-LG都主要是静态猝灭[23-24]。这与β-LG和U-β-LG的荧光光谱结果一致。U-β-LG在最大吸收波长处和278 nm处的吸收强度都大于β-LG，可能是由于β-LG在微波处理之后发生了去折叠[12]，三级结构发生变化。

图3 不同浓度EGCG与β-LG或U-β-LG的紫外吸收光谱Fig. 3 UV absorbance spectra of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

2.4 结合常数和结合位点数

对于静态猝灭，假设在蛋白质上有多个独立的结合位点，则配体和蛋白质之间的相互作用的结合常数和结合位点数可以通过方程式（2）[25]求得：

式中：Ka为结合常数/（L/mol）；n为每个蛋白分子可能的结合位点数。

图4 不同温度条件下β-LG（A）和U-β-LG（B）与EGCG相互作用的双对数回归曲线Fig. 4 Double logarithmic regression curves for interaction of EGCG with β-LG (A) and U-β-LG (B) at different temperatures (pH 6.8)

根据方程式（2），以lg[（F0－F）/F]为纵坐标，lg[Q]为横坐标作图，得到EGCG对β-LG和U-β-LG荧光猝灭的双对数曲线，如图4所示。在288、298 K和308 K条件下，EGCG与β-LG和U-β-LG之间的结合常数和结合位点数列于表1。结合常数越大表明配体与蛋白质之间的结合力越强。在同一温度条件下，U-β-LG的结合常数均大于β-LG的结合常数，这表明EGCG与U-β-LG的结合强度大于β-LG。随着温度的升高，β-LG和U-β-LG的结合常数都增大，这说明EGCG与β-LG或U-β-LG之间存在共价形式的相互作用，但是其中主要还是非离子形式存在的相互作用[9]。温度可能会影响到EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG 体系的扩散系数和稳定性。温度升高会导致扩散系数增大，并使得EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG体系的稳定性降低。随着温度的升高，EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG体系的扩散系数和稳定性之间的竞争可能就是导致结合常数增大的原因[26]。在288、298 K和308 K条件下，EGCG与U-β-LG的结合位点数均大于β-LG，这可能是由于微波处理使得β-LG去折叠，暴露出了部分原本隐藏着的结合位点[27]。

2.5 热力学参数

氢键、范德华力、疏水作用力、静电相互作用等是配体与蛋白质之间的主要非共价作用力。有研究表明，蛋白质-配体之间的非共价力可以依据热力学参数焓变值（ΔH）和熵变值（ΔS）进行表征：当ΔH小于0、ΔS小于0时，分子间的作用力主要是氢键、范德华力或质子化等作用；当ΔH大于0、ΔS大于0时，分子间的作用力主要是疏水作用力；当ΔH小于0、ΔS大于0时，分子间的作用力主要是静电引力；当ΔH大于0、ΔS小于0时，分子间的作用力主要是疏水作用力和静电引力[14]。吉布斯自由能（ΔG）、焓变值和熵变值这些热力学参数可以通过Van’t Hoff方程[14]（3）、（4）计算得到：

式中：R为气体常数8.314 J/（mol·K）；T为实验温度/K；Ka为在相应的温度（288、298 K和310 K）条件下的结合常数/（L/mol）。

如表1所示，EGCG与β-LG或U-β-LG的结合反应ΔG都为负值，说明EGCG与这2 种蛋白质的结合过程都是自发进行的；EGCG与β-LG或U-β-LG的ΔH和ΔS都为正数，说明EGCG与这2 种蛋白质间的作用力主要为疏水作用力。

2.6 能量转移和结合距离

EGCG对β-LG或U-β-LG的荧光猝灭可能是结合的EGCG与β-LG和U-β-LG之间发生了能量转移。根据Föster非辐射能量转移理论，当蛋白质的荧光发射光谱与配体的吸收光谱有足够的重叠，而且蛋白质与配体的最大距离不超过7 nm，则配体与蛋白质的能量转移效率（E）和结合距离（r）可通过关系式[16]（5）～（7）计算：

式中：R0为转移效率为50%时从配体到蛋白质的Föster临界能量转移距离/nm；r为结合的配体与蛋白质之间的距离/nm；K2为配体、蛋白质的空间取向因子（K2=2/3）；N为介质的平均折射指数（N=1.359 8）；Φ为蛋白质的荧光量子产率（Φ=0.15）；J为蛋白质的荧光发射光谱与配体的吸收光谱之间的光谱重叠积分/（（cm3·L）/mol）；F（λ）为蛋白质在波长为λ的荧光强度；ε（λ）为配体在波长λ时的摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））。

图5 β-LG（A）和U-β-LG（B）的荧光光谱与EGCG的吸收光谱Fig. 5 Overlapping emission spectra and absorption spectra of β-LGEGCG complex (A) and U-β-LG-EGCG complex (B)

表2 298 K时的Föster非辐射能量转移参数Table 2 Parameters of Förster non-radiation energy transfer at 298 K

根据图5计算得到298 K时EGCG与β-LG或U-β-LG的Föster非辐射能量转移参数，如表2所示。可知EGCG到β-LG或U-β-LG的距离均在2～7 nm之间，这进一步说明EGCG对β-LG或U-β-LG的内源荧光的猝灭相较于动态猝灭更可能是静态猝灭[28]。而EGCG到U-β-LG的距离小于到β-LG的距离，可能是由于微波处理的β-LG发生了去折叠，使得原本隐藏的结合位点暴露了出来，导致结合距离变小。

2.7 远紫外圆二色光谱分析

图6 β-LG和U-β-LG在不同浓度EGCG条件下的远紫外圆二色光谱图Fig. 6 Far-UV circular dichroism spectra of 0.1 mg/mL β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

表3 β-LG和U-β-LG与不同物质的量比的EGCG结合的二级结构相对含量Table 3 Secondary structure contents of β-LG and U-β-LG upon interaction with EGCG in different molar ratios of ligand to protein

如图6所示，不同浓度EGCG存在条件下的β-LG在180～200 nm有一正谱带，在216～218 nm有一个负峰，这是β-折叠结构的典型特征；不同浓度EGCG存在条件下的U-β-LG在192 nm附近有一个正吸收峰，在208 nm和222 nm附近有负的吸收峰，这是α-螺旋的典型特征。β-LG和U-β-LG二级结构的相对含量由DichroWeb程序得到，如表3所示。微波处理的U-β-LG的β-折叠相对含量显著少于β-LG，α-螺旋大于β-LG（P＜0.05），这进一步证明了微波处理使得β-LG发生了去折叠。加入EGCG后，U-β-LG的α-螺旋相对含量均增加，β-折叠相对含量都减少，β-转角和无规卷曲的相对含量之和减少。而EGCG引起的β-LG的二级结构变化不明显。这说明在与EGCG结合的过程中，配体诱导的结构变化是在结合位点附近的局部变化，不涉及到蛋白质折叠和稳定性的显著变化[29-30]。相较于EGCG对β-LG二级结构的影响，可以检测到EGCG存在时U-β-LG更多的变化，这可能是由于EGCG与U-β-LG的相互作用更强[30]。这与内源性荧光的检测结果相符。

2.8 外源性荧光光谱分析

图7 不同浓度EGCG对β-LG或U-β-LG的表面疏水性的影响Fig. 7 Surface hydrophobicity of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

蛋白质表面疏水性是蛋白质的表面与极性水溶液环境相接触的疏水基团的参数。β-LG的表面疏水性大小是通过其表面的疏水性氨基酸与ANS形成的结合物的荧光强度表示。如图7所示，微波处理U-β-LG的荧光强度大于β-LG的荧光强度，且发生了轻微蓝移，这可能是微波处理后β-LG发生了去折叠，β-LG分子间的疏水作用遭到了破坏，暴露出了更多的β-LG内部疏水基团，从而增加了β-LG的表面疏水性[31]。而EGCG与β-LG和U-β-LG之间的作用力主要是疏水作用力，这可能是EGCG与U-β-LG的结合能力更高的原因。随着EGCG浓度的增大，β-LG和U-β-LG的荧光强度均减小，表面疏水性降低。这与内源性荧光的结果相一致。可能是由于EGCG与β-LG或U-β-LG通过疏水作用结合后形成的复合物破坏了β-LG和U-β-LG原本的疏水结构[20]，降低了它们与ANS结合的能力。而U-β-LG与EGCG的结合能力比β-LG强可能是导致U-β-LG荧光强度降低程度小于β-LG的原因。

3 结 论

本研究通过光谱学方法研究EGCG与微波处理得到的U-β-LG的相互作用机制，并与天然β-LG相比较。结果表明，EGCG与U-β-LG主要是通过疏水作用力形成复合物。相较于天然β-LG，β-LG去折叠可以使蛋白质与EGCG的结合强度增大，结合位点增多，结合距离变小。在与EGCG结合的过程中，U-β-LG的二、三级结构变化大于天然β-LG，但是配体诱导的结构变化是在结合位点附近的局部变化，不涉及到蛋白质折叠和稳定性的显著变化。微波导致的蛋白质去折叠有利于蛋白质与配体的相互作用。