外源性抑制Wnt信号通路对BMP-2诱导的人牙髓细胞向成牙本质分化的影响

浦铁民，韩亚琨

(1吉林医药学院附属医院，吉林 132011;2中国医科大学)

外界刺激可诱发牙本质的形成或修复。修复性牙本质形成过程中，人牙髓细胞(HDPC)分化为成牙本质样细胞取决于多种因子与信号通路的调控[1]。骨形态发生蛋白(BMP)在成牙本质细胞分化过程中发挥重要作用。另外，碱性磷酸酶(ALP)、牙本质基质蛋白(DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)等目前已作为判断HDPC牙本质细胞分化的分子标志[2]。然而，目前对调节牙髓成牙本质细胞分化的分子信号研究仍有限。相关研究显示，Wnt 信号在细胞增殖和分化过程中发挥广泛的调控作用[3]。2017年11月，本研究拟探讨外源性抑制Wnt人信号通路对BMP2诱导的HDPC向成牙本质分化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HDPC购自ATCC。10%FBS、Heracell VIOS 160i CO2细胞培养箱、BCA蛋白浓度检测试剂盒、ABI 7500型实时荧光定量PCR系统、Quantity One软件(德国赛默飞世尔科技公司)，DKK-1蛋白(上海鑫乐生物科技有限公司)，青霉素、链霉素、DMEM培养基(美国GIBCO公司)，乙醇胺、MgCl2(北京拜尔迪生物技术有限公司)，对硝基苯磷酸(上海宝曼生物科技有限公司)，DSPP、DMP-1抗体(巴傲得生物科技有限公司)，核固红(上海恒远生物技术发展有限公司)，核蛋白提取试剂盒(北京基莱生物科技有限公司)，TRIzol reagent、反转录试剂盒、SYBR Green(大连宝生物工程有限公司)，蛋白提取试剂盒(北京泰泽瑞达科技有限公司)，β-catenin抗体(美国CST中国分公司)，LAMIN A单克隆抗体(上海翊圣生物科技有限公司)，二抗 IgG、Odyssey®红外成像系统(LI-COR Biosciences公司)，多功能酶标仪(Bio-Rad，上海伯乐生命医学产品有限公司)。

1.2 HDPC细胞形态观察 将HDPC细胞系置于在含有10%FBS，100 U /mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。于镜下观察细胞。

1.3 HDPC 预处理及分组 取传至第三代的细胞，以3×104细胞/孔分别接种至4个24孔板中，于37 ℃ 5%CO2的细胞培养箱培养。当细胞密度接近70%时，将细胞分为三组，每组8孔：对照组(对照组)，不做任何特殊处理；单纯BMP-2诱导组(单纯诱导组)将培养液更换为BMP-2诱导液(将BMP-2溶于完全培养基中，配成浓度为100 ng/mL的培养液)，连续培养；Wnt抑制剂DKK-1处理后再诱导组(抑制剂处理组)于培养基中加入DKK-1蛋白至终浓度为100 ng/mL，培养24 h后，将培养液更换为BMP-2诱导液，连续培养。

1.4 各组细胞核β-catenin蛋白表达检测 细胞培养10 d后，收集培养细胞，利用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，具体操作参照试剂盒说明书。BCA蛋白浓度检测试剂盒检测核蛋白浓度。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，全湿法转至PVDF膜。5%脱脂乳4 ℃封闭过夜，PBS缓冲液洗膜，β-catenin抗体(1∶100稀释)或LAMIN A单克隆抗体(1∶1 000稀释)作为一抗，室温孵育膜3 h，PBS缓冲液洗膜。室温条件下，二抗 IgG(1∶20 000稀释)孵育2 h，PBS缓冲液洗膜，高压ddH2O洗膜，Odyssey®红外成像系统对蛋白表达量进行分析。使用Quantity One软件分析蛋白表达。

1.5 ALP活性检测 采用PNPP偶氮法检测。收集细胞至预冷PBS缓冲液中冰浴，1 500 r/min离心6 min。取上清，利用ALP混合物(0.1 mol/L乙醇胺、1 mmol/L MgCl2和10 mg/mL对硝基苯磷酸)37 ℃孵育30 min，加入氢氧化钠终止反应，多功能酶标仪于410 nm处读取光密度值。

1.6 钙化结节数量计算 采用Von Kossa染色。收集细胞，加入5%硝酸银溶液处理细胞，暴露细胞于紫外光线下30 min，5%硫代硫酸钠中和2 min，蒸馏水洗涤细胞5 min。细胞核固红染色1 min。每组细胞随机选择8个区域，40倍镜下观察，利用Scion Image软件(Scion Corp.)对染色密度进行定量分析。

1.7 各组细胞DSPP、DMP-1 mRNA和蛋白表达检测 应用实时荧光定量PCR检测各组细胞DSPP、DMP-1 mRNA相对表达。使用TRIzol reagent试剂盒提取总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以GADPH为内参，使用SYBR Green于ABI 7500型实时荧光定量PCR系统进行实时荧光定量。每个样品设置3个重复孔，2-ΔΔCt法计算分析结果。应用蛋白免疫印迹法检测各组细胞DSPP、DMP-1蛋白表达。应用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，具体操作参照试剂盒说明书。BCA蛋白浓度检测试剂盒检测总蛋白浓度。10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜。5%脱脂乳4 ℃封闭过夜，洗膜，DSPP、DMP-1抗体(1∶200稀释)或β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)作为一抗，室温孵育膜3 h，洗膜。荧光二抗IRDye 680RD donkey anti-mouse IgG(1∶20 000稀释)孵育2 h，洗膜，Odyssey®红外成像系统对蛋白表达量进行分析。使用Quantity One软件分析蛋白表达。DSPP正向引物5′-AATTTGCATCTCCTAGC-3′，反向引物5′-GAAAAACTCTTCCCTCC-3′；DMP-1正向引物5′-TTCATTGGGCATAGATTTC-3′，反向引物5′-TACCTGGTTACTGGGAGAG-3′；GADPH正向引物5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反向引物5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′。

2 结果

2.1 HDPC形态 显微镜下观察，HDPC细胞培养至第2天时，数量增加，形态不一，多呈多角性、梭形。培养至第4天时，细胞增殖迅速，排列紧密，细胞融合率达90%，可进行传代。

2.2 各组细胞核β-catenin蛋白表达比较 对照组、抑制剂处理组、单纯诱导组HDPC核β-catenin蛋白表达量分别为1.00±0.18、0.25±0.04、0.67±0.09;与对照组相比，单纯诱导组、抑制剂处理组中HDPC细胞核β-catenin蛋白表达均下调(P均<0.05);与单纯诱导组相比，抑制剂处理组中HDPC细胞核β-catenin蛋白表达下调(P<0.05)。

2.3 各组ALP活性比较 对照组、抑制剂处理组、单纯诱导组ALP活性分别为1.00±0.05、2.21±0.13、1.40±0.11;与对照组相比，单纯诱导组、抑制剂处理组ALP活性增加(P均<0.05);与单纯诱导组相比，抑制剂处理组ALP活性增加(P<0.05)。

2.4 各组细胞钙化结节数量比较 对照组、抑制剂处理组、单纯诱导组Von Kossa染色密度定量值分别为1.23±0.77、0.41±0.15、0.20±0.07;与对照组相比，单纯诱导组、抑制剂处理组钙化结节数量增加(P均<0.05);与单纯诱导组相比，抑制剂处理组钙化结节数量增加(P<0.05)。

2.5 各组细胞DSPP、DMP-1表达比较 与对照组相比，单纯诱导组、抑制剂处理组中DSPP、DMP-1 mRNA与蛋白表达均增加(P均<0.05);与单纯诱导组相比，抑制剂处理组DSPP、DMP-1 mRNA与蛋白表达增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组DSPP、DMP-1表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与抑制剂处理组相比，#P<0.05。

3 讨论

牙髓细胞具有可塑性和多向分化潜能的能力，其分化潜能是牙髓牙本质复合体对损伤应答及形成修复性牙本质的决定性因素[4]。骨形态发生蛋白(BMP)可刺激成牙本质细胞分化和牙本质基质分泌，从而促进修复性牙本质的形成[5]。相关研究证实，BMP-2具有诱导成牙本质细胞分化的作用[6]。本研究证实，BMP-2可诱导HDPC成牙本质向分化，与过往研究一致。

Wnt信号通路参与细胞增殖、迁移及分化的调节，在多种组织干细胞分化过程中发挥重要调控作用[7]。Cho等[8]研究发现，内源性Wnt信号通路可促进人脂肪基质细胞增殖和抑制成骨分化。β-catenin是经典Wnt信号通路中关键因子，细胞核内β-catenin表达可直接反映该通路活性。近来研究发现，经典Wnt/β-catenin信号通路参与牙根发育过程[9]。在经典Wnt信号通路中，Wnt与 FZD、LRP-5/6受体结合形成复合体，引起DVL聚集及Axin的降解，酪蛋白激酶Iε对DVL进行磷酸化，磷酸化的DVL与Frat1结合抑制GSK-3β活性，GSK-3β、Axin、APC结合受抑，导致β-catenin发生核内转移，从而影响一系列相关蛋白表达。DKK-1是经典Wnt信号通路常用竞争性抑制剂之一。本研究发现，抑制剂处理组中HDPC细胞核β-catenin蛋白表达量显著下调，提示抑制剂处理组DKK-1成功抑制细胞Wnt信号通路。

成牙本质细胞分化与矿化前期需经历细胞增殖与细胞外基质的合成时期，在此阶段可检测到基质成熟蛋白和特异性蛋白的表达，如ALP，由于发生成牙本质细胞分化的细胞中ALP高于未分化的细胞，因此ALP被认为是成牙本质细胞分化的早期标志物[10]。本研究发现，抑制剂处理组ALP活性较对照组、单纯诱导组增加，差异有统计学意义，与von Kossa染色结果一致，同时抑制剂处理组钙化结节数量显著增加，提示抑制Wnt信号通路活化能促进BMP-2诱导成牙本质细胞分化过程。

DSPP、DMP-1是判断成牙本质细胞分化的重要指标。DSPP属于非胶原基质，为牙本质和骨特异性基因，在牙本质矿化和牙齿发育中起重要作用，但DSPP合成后即被酶切为DSP和DPP[11]。Jia等[12]研究发现，在成牙本质细胞分化过程中，DSPP基因突变可致矿化平衡紊乱，造成严重的牙本质疾病。DMP-1属于牙本质特异性磷酸性蛋白，于成牙本质细胞分化早期发生特异性表达，通常与DSPP协同判断成牙本质细胞分化情况[13]。本研究结果显示，抑制剂处理组细胞中DSPP、DMP-1 表达显著增加，提示Wnt信号通路发生抑制可促进BMP-2诱导成牙本质细胞分化过程中DSPP和DMP-1的表达。

综上所述，外源性抑制Wnt信号通路，可促进BMP-2诱导HDPC分化为成牙本质细胞。