H2O2预处理结合微生物发酵提取玉米芯木聚糖的工艺研究

傅 杰，王 园，王瑞芳，陈秋燕，郭俊清，冯 霞，安晓萍*，齐景伟*

1内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；2内蒙古优牧特农牧科技股份有限公司，呼和浩特 010010

木聚糖是植物细胞中半纤维素的重要组成成分，是自然界中第2丰富的可再生物质[1]。木聚糖具有广泛的生物活性，如调节免疫、抗肿瘤、降血糖、益生等[2-5]。随着社会对木聚糖需求的日益增加，寻求一种高效快速的木聚糖提取、制备技术已成为食品添加剂行业发展的需求。

玉米芯作为一种丰富、廉价、富含半纤维素的玉米加工副产物，常用作木聚糖提取的理想原料。然而，自然状态下玉米芯的纤维素、半纤维素和木质素交联在一起，形成了致密的纤维结构。为了能有效地从玉米芯细胞壁中提取木聚糖，常采用物理法、化学法、生物法以及三种方法的结合利用的提取方法。本实验室前期已对菌酶协同发酵法提取玉米芯木聚糖进行了研究，发现枯草芽孢杆菌与酿酒酵母1∶9的比例发酵玉米芯的同时，添加纤维素酶量1 000 U/g，产物中木聚糖含量可达1.421 mg/g，与对照组相比提高了257%[6]。但此研究结果所得玉米芯木聚糖含量远低于其他方法[7，8]。为了更有效地从玉米芯中提取木聚糖，本研究采用微生物发酵结合H2O2预处理的方法提取玉米芯木聚糖，并利用SEM法初步探讨了该方法提高玉米芯木聚糖含量的原因，以期为微生物发酵玉米芯生产木聚糖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：枯草芽孢杆菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)和酿酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119)均购买于中国微生物菌种保藏中心。

原料：玉米芯原料购买于市场，粉碎过筛(20目)。

培养基：营养肉汤培养基、麦芽汁培养基均购买广东环凯微生物科技有限公司。

试剂：D-木糖：分析标准品，Aladdin公司。过氧化氢、尿素、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、四水酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

仪器与设备：SW-CJ超净工作台、上海新苗医疗器械；GX2型智力光照培养箱、宁波东南仪器有限公司；QYC-200恒温培养摇床、上海福玛实验设备有限公司；TG16-WS台式高速离心机、湖南湘仪仪器开发有限公司；微孔板分光光度计、美国伯腾仪器有限公司；JSM-6390LV扫描电镜、JEOL公司；IB-3型离子镀金仪喷金镀膜、Eiko公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

酿酒酵母菌：将冷冻保存的酿酒酵母经过麦芽汁琼脂培养基活化48 h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于酿酒酵母种子液培养基中，置于28 ℃，120 rpm的摇床中培养24 h，备用。

枯草芽孢杆菌：将冷冻保存的枯草芽孢杆菌经营养肉汤琼脂培养基活化24 h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于枯草芽孢杆菌种子液培养基中，置于36 ℃，120 rpm的摇床中培养24 h，备用。

1.2.2 H2O2预处理玉米芯

分别将0%、0.5%、1%、2%、4%的双氧水(相对于原料)与2 mL蒸馏水、1 g玉米芯粉混匀，室温下放置0、0.5、1、2、4 h。然后经高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件为121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量为测定指标，确定出H2O2的添加量和预处理时间。

1.2.3 预处理方法对比

分别将4%H2O2、0.5%尿素以及4% H2O2加0.5%尿素(相对于原料)与2 mL蒸馏水、1 g玉米芯粉混匀，室温下放置1 h。经高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件为121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量为测定指标，确定出最适预处理方法。

1.2.4 微生物发酵玉米芯

将经预处理与未预处理的玉米芯分别进行发酵，其发酵条件为：发酵菌种酿酒酵母和枯草芽孢杆菌接种比例为9∶1，发酵底物由15 g玉米芯、0.15 g尿素、0.15 g葡萄糖、18 g水组成，发酵温度36 ℃，发酵时间48 h，接种量为10%。以木聚糖含量为测定指标，考察H2O2预处理对微生物发酵提取玉米芯木聚糖的影响。

1.2.5 单因素优化微生物发酵提取木聚糖的培养基组成

分别研究含水量、尿素添加量和葡萄糖添加量对玉米芯木聚糖提取率的影响。含水量为45%、50%、55%、60%；尿素添加量为0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%；葡萄糖添加量为0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%。

1.2.6 响应面优化微生物发酵提取木聚糖的培养基组成

在单因素试验基础上，确定含水量(A)、葡萄糖添加量(B)、尿素添加量(C)的取值范围，采用Box-Behnken试验设计三因素三水平的响应面优化试验，以发酵底物中玉米芯木聚糖得率(Y)为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，得出微生物发酵提取玉米芯木聚糖的培养基组成。响应面因素设计见表1。

表1 响应面分析试验因素与水平

1.2.7 木聚糖含量测定

将处理后的玉米芯于45 ℃烘箱中烘干(24 h)，1 g干燥玉米芯加入10 mL蒸馏水，80 ℃水浴30 min后，放于5 000 rpm的高速离心机中离心15 min，上清液备用。取1 mL上清液，加入6 mol/L盐酸3 mL，沸水浴2 h，迅速冷却，用6 mol/L的NaoH中和水解液并调节pH为中性，用蒸馏水稀释至10 mL[9]。本实验以木聚糖为标准品，采用DNS法测定还原糖含量，再将其乘以稀释倍数10和换算系数0.88，即得到木聚糖含量[10]。

1.2.8 扫描电镜

样品用IB-3型离子镀金仪喷金镀膜后，使用JSM-6390LV扫描电镜直接上机观察。

1.3 数据统计分析

试验数据采用SAS9.2统计软件进行ANOVA单因素方差分析，并用Duncan’s 法进行多重比较，P<0.05为差异显著；采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 H2O2预处理对玉米芯木聚糖含量的影响

玉米芯经浓度0.5%～4% H2O2预处理不同时间后，木聚糖含量变化见表2。由表2可见，随着H2O2处理玉米芯的时间延长，木聚糖含量呈现先升高后降低的变化，各浓度H2O2预处理组中木聚糖含量最高均出现在处理1 h。且玉米芯木聚糖含量随着H2O2浓度增加而增加，在4% H2O2处理玉米芯1 h后，木聚糖含量可达40.21±0.21 mg/g，较未经H2O2处理组提高了98.56%(20.25±0.83 mg/g)。因此选择4%H2O2预处理玉米芯1 h。

表2 H2O2浓度与处理时间对玉米芯木聚糖含量的影响

注：与空白对照组相比，*表示存在差异显著(P<0.05)；a,b,c同列数据肩标不同表示差异显著(P<0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note:Compared with control,*indicated significant difference (P<0.05 );a,b,c in the same column,values with different superscripts indicated significant difference (P<0.05 );While with the same superscripts indicated no significant difference (P>0.05 ).Same as below．

2.2 H2O2结合尿素预处理对玉米芯木聚糖含量的影响

如图1所示，玉米芯经H2O2、尿素、H2O2+尿素处理后，木聚糖含量分别达44.27 mg/g、31.11 mg/g、37.21 mg/g，木聚糖含量均较玉米芯原料有显著提高，且H2O2处理组的木聚糖含量最高。尽管尿素具有破坏纤维素、木质素的致密结构[11]，促进木聚糖的释放，但本研究中玉米芯经H2O2处理释放木聚糖效果优于尿素处理和H2O2+尿素处理，因此，选择H2O2对玉米芯进行预处理。

2.3 H2O2预处理对微生物发酵提取玉米芯木聚糖的影响

预处理的目的是破坏木质纤维素结构、脱去木质素或半纤维素，同时增大微生物与底物的接触面积，提高发酵效率。玉米芯经H2O2预处理后，利用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌混合发酵，其产物中木聚糖含量分别为52.72 mg/g，而未经预处理的玉米芯发酵产物中木聚糖含量为20.95 mg/g(如图2)，H2O2预处理显著提高了微生物发酵效率(P<0.01)，发酵产物中木聚糖含量提高了151.64%。

图1 不同预处理对木聚糖含量的影响Fig.1 Effect of Different Pretreatments on Xylan Content

图2 H2O2预处理对微生物发酵玉米芯中木聚糖含量的影响Fig.2 Effect of H2O2 pretreatments on the content of xylan from microbial fermentation corncob

2.4 单因素试验结果

图3 含水量(a)、尿素(b)和葡萄糖(c)对发酵玉米芯中木聚糖含量的影响Fig.3 Effects of water content,urea and glucose on the contents of xylan from fermented corncob

由图3 a可知，含水量对发酵产物中木聚糖含量有一定的影响，随着培养基中含水量的增加，发酵产物中木聚糖含量呈现先增大后减少的趋势。含水量50%时，木聚糖含量达到最高值60.04 mg/g，显著高于其他料水比(P<0.05)。因此，选择培养基中含水量为50%。同理由图3 b和图3 c可得，确定出尿素添加量为0.25%、葡萄糖添加量为0.75%，在此条件下，木聚糖含量可达65.06 mg/g。由SAS 9.2软件方差分析可知，三因素不同添加量对木聚糖含量的影响均显著(P<0.05)。

2.5 响应面优化结果与分析

2.5.1 响应面结果

在单因素结果基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken试验设计及分析方法对含水量(A)、葡萄糖添加量(B)和尿素添加量(C)进一步优化，试验结果见表3。

利用Design-Expert 8.0软件，通过对多项式回归分析，得到的拟合全变量二次回归方程模型为：Y=65.85+2.62A+0.11B+2.01C+1.38AB-0.65AC+1.04BC-4.09A2-1.62B2-3.62C2。

表3 Box-Behnken响应面优化试验设计及结果

回归模型各项的方差分析见表4。由表4可知，该模型P值为0.037 8，表明回归模型极显著，失拟项的P值为0.758 8大于0.05，模型失拟不显著，试验误差小[12]，由此说明用该模型对微生物发酵提取玉米芯木聚糖的培养基组成进行优化是可行的。由F值可知，三因素对发酵产物中玉米芯木聚糖含量影响的顺序为：含水量(A)>尿素添加量(C)>葡萄糖添加量(B)。

表4 回归模型方差分析结果

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。

Note:*Significant difference (P<0.05);**extremely significant difference (P<0.01).

2.5.2 响应面分析

图4为各交互因素对发酵产物中木聚糖含量影响的响应面。由图4可知，两因素交互作用对木聚糖含量影响并不显著(P>0.05)，图4(A)表示，随着含水量的增加，木聚糖含量呈逐渐上升后下降的趋势。图4(B)中，含水量和尿素添加量的增加，木聚糖含量也逐渐上升。表4中，二次项A2、C2对木聚糖含量均有显著影响(P<0.05)，进一步说明各因素对木聚糖含量的影响不是简单地线性关系。

图4 各因素之间的交互作用影响Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the content of xylan

2.5.3 优化培养基组成的验证

用 Design-expert 8.0 软件对二次多项式回归方程进行计算，得出的最优培养基组成为含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，在该条换下玉米芯木聚糖含量为69.337 mg/g，在此条件下进行5次重复发酵试验，实际玉米芯木聚糖含量为70.84 mg/g。与理论值偏差2.16%，说明此模型有效且优化结果可靠。该优化结果比未发酵玉米芯木聚糖含量提高249.82%。

2.6 电镜扫描

玉米芯原料、H2O2预处理玉米芯、微生物发酵+H2O2预处理玉米芯本研究利用扫描电镜观察经过一系列处理后玉米芯微观结构变化。SEM扫描结果如图5，玉米芯(图5 a)表面光滑，结构致密，没有孔洞损伤。玉米芯经过H2O2预处理后，表面出现较多坑洞，结构变得疏松，木质素结构受到一定破坏，木质素与纤维素和半纤维素之间连接的共价键发生了断裂(图5 b)；玉米芯经过微生物发酵+H2O2预处理后，玉米芯表面孔洞更大更多，结构更疏松(图5 c)。H2O2预处理后玉米芯较疏松的结构可显著增加微生物菌体细胞及其产生的酶与玉米芯表面的接触，提高微生物对玉米芯中木质纤维素的降解效率[13],促进木聚糖的释放。

图5 预处理前后玉米芯的扫描电镜图(100×，20×)Fig.5 SEM of corncob before and after pre-treatment(100×，20×)

3 结论

玉米芯内部结构复杂，而木质素又紧密包裹在纤维素和半纤维素周围，形成天然抗降解屏障，保护纤维素和半纤维素不受微生物的破坏[14]。因此，去除木质素是解除玉米芯天然抗降解屏障、提高微生物发酵效率的首要任务。预处理可以增加底物的多孔性，进而增加可及性，显著提高微生物发酵效率[15]。H2O2作为去除木质素的去除试剂，玉米芯的细胞壁结构被H2O2氧化后，细胞壁外面包围的木质素被软化，半纤维素和纤维素与木质素之间的氢键发生断裂，微生物可更好的利用纤维素和半纤维素从而提高发酵效率，释放更多木聚糖[14-16]。本实验中玉米芯经H2O2预处理后再发酵，其发酵产物中木聚糖含量52.72 mg/g，较未经H2O2预处理玉米芯发酵产物中木聚糖含量提高了186.76%。

将H2O2预处理玉米芯作为培养基，利用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌混合固态发酵，其产物中木聚糖含量可达70.84 mg/g，较H2O2预处理玉米芯中木聚糖含量提高了60.01%(44.27 mg/g)，由此可见微生物发酵可显著提高玉米芯木聚糖含量。这可能是由于酿酒酵母属于真菌，真菌降解纤维素的主要机制是分泌大量的胞外酶来破坏木质纤维素的紧密结构，从而有效降解玉米芯。枯草芽孢杆菌属于细菌，细菌降解木质纤维素的机制是主要通过分泌的纤维素酶的纤维素结合域附着在木质纤维素的表面，纤维素受细菌作用易于膨胀而被破坏分解[17，18]，从而促进玉米芯木聚糖的释放。

通过H2O2预处理能够提高微生物发酵效率，提高玉米芯木聚糖释放，其结构的变化是玉米芯木聚糖含量提高的内在原因。SEM图像表明，玉米芯纤维素、木质素相互缠绕的致密结构及其表层均被H2O2破坏，更容易被微生物利用，从而经微生物发酵后的玉米芯表面孔洞更大更多，结构变得更疏松。本实验采用微生物发酵结合H2O2预处理提取玉米芯中木聚糖，其最佳工艺为：4%H2O2预处理玉米芯原料1 h后，采用酿酒酵母：枯草芽孢杆菌9∶1比例发酵，发酵培养基组成为含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，该条件下玉米芯木聚糖含量可达70.84 mg/g。