枸杞多糖的抗炎镇痛作用研究

杜军霞，宫彬彬，宋 菲，盖璐楠

邢台学院生物科学与工程学院，邢台 054001

枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是枸杞中主要生物活性成分之一，具有抗辐射、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用[1,2]。研究显示LBP能够提高机体特异性免疫及机体自然杀伤细胞的杀伤力，提升白细胞水平，对脾脏和胸腺T细胞有刺激作用，还能增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，同时也表现出显著的抗炎作用[3,4]，体外研究证明LBP能够降低致炎因子一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)等分子的含量，并且显著抑制了炎症相关蛋白ERK、p38、MAPK等的基因表达，表现出良好的抗炎作用[3]。炎症往往伴随着慢性疼痛出现，即炎症痛，其发生发展过程与外周致炎因子的含量有关，更重要的是发生在神经系统内部的敏化机制。有研究显示LBP能够明显缓解了坐骨神经损伤模型大鼠的自噬和疼痛现象，同时抑制了神经瘤的形成[5]，但关于LBP在体的抗炎和镇痛作用的报道少见。本文通过小鼠福尔马林炎症疼痛模型，观察LBP的抗炎镇痛作用并对其抗炎症痛作用的分子机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级昆明小鼠20～22 g，雄性30只，雌性20只，购于河北医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(冀)2018-004)；出生后7～8天大鼠，购于北京大学医学部实验动物中心(许可证号：SCXK(京)2016-0010)。

1.2 主要实验材料和试剂

枸杞多糖(LBP)(北京源叶生物公司)，小鼠IL-6ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，1706H)，38%甲醛溶液，Neurobasal 试剂(Invitrogen),Fura-2 AM(Biotium)，辣椒素(Enzo Life Sciences)，2.5 M KCl(Sigma)，PBS(NaCl 8 g，Na2HPO4·POg2O 2.08 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g溶于800 mL ddH2O中，调pH值至7.2～7.4，定容至1 L)，ES液(NaCl 7.6 g，KCl 0.37 g，KH2PO40.272 g，CaCl20.277 5，MgCl20.095 g，HEPES 2.383 1 g，glucose 1.8 g，溶于900 mL dd H2O 中，溶解完全后调pH值至7.2，定容至1 L，用蔗糖调节渗透压至295～300 mOsm)。

1.3 动物行为学实验

1.3.1 小鼠热板实验

雌性昆明小鼠20只，随机分为对照组(Ctr)和实验组(LBP)，灌胃给药前分别将小鼠放入52 ℃恒温水浴板上，以小鼠舔足为指标，观察记录小鼠热板潜伏期作为基值，之后两组分别灌胃给予生理盐水(2 mL/kg体重)或LBP(20 mg/kg体重)溶液，连续7天，1次/天，于最后一次灌胃30 min后进行热板实验，记录小鼠热板潜伏期，并与基值作比值来反映LBP对热板反应潜伏期的影响。

1.3.2 小鼠福尔马林炎症模型实验

雄性昆明小鼠30只随机分为对照组(Ctr)、模型组(FM)、实验组(LBP)三组。模型组和实验组分别灌胃生理盐水(2 mL/kg体重)和LBP(20 mg/kg体重)连续7天，1次/天，于最后一次灌胃后在右后足底皮下注射1%福尔马林20 μL，观察并记录小鼠的I相和II相自发痛行为。

1.4 IL-6的检测

福尔马林痛模型4 h后迅速摘眼球取血，将血液室温静置40 min，取上层血清备用。取血后小鼠经断头处死，迅速用手术剪纵向剪开背部皮肤，取下颈椎至尾椎部位的脊柱，用灌有4 ℃预冷生理盐水的20 mL注射器将脊髓从椎管中推出，取其腰膨大处约1.5 cm长度的组织，用预冷PBS溶液进行冰上研磨20 min，4 ℃ 10 000 rpm离心5 min，并取上清备用。采用小鼠IL-6分子ELISA试剂盒对血清和脊髓裂解液中的IL-6进行检测。

1.5 钙成像实验

原代培养出生后7～8天的大鼠DRG组织细胞，正常培养2～3天后换用LBP(80 μg/mL)(LBP组)或生理盐水(Ctr组)进行预处理6 h，用ES液轻洗细胞两次，加入适量稀释于ES液的终浓度5 M Fura2-AM，室温孵育40 min，换为ES液，室温恢复1 h后，于钙成像试验平台进行实验记录基础钙离子信号状况，信号稳定后加入1 μM辣椒素刺激，同时观察钙离子信号变化。以F340/F380比值变化代表细胞内钙离子浓度变化。利用2.5 M KCl对神经元进行刺激，以排除整体活性低和状态较差的细胞。

1.6 数据统计

数据处理采用t-检验(t-tests)和多因素方差分析(Two-way ANOVA)，数据分析及作图用Graph Pad Prism 5软件进行。

2 结果

2.1 LBP对生理性热痛觉影响

为检测LBP对生理性痛觉的影响，进行热板实验，结果显示，LBP处理前后，小鼠的热板反应潜伏期变化不明显，热板反应潜伏期与基值的百分比与对照组(Ctr)小鼠相比并无显著性差异(图1)，说明LBP对于小鼠的正常生理性热痛觉感受功能没有明显影响。

图1 LBP对小鼠热板实验潜伏期的影响Fig.1 The effect of LBP on latent period of hot plate test注：NS代表LBP组和对照组比较，无显著性差异。Note:NS showed no significant difference between LBP group and saline control group.

2.2 LBP对福尔马林炎症痛模型具有镇痛作用

给小鼠右后足底注射1%福尔马林20 μL，模型组(FM)小鼠出现明显的两相疼痛，与空白对照组小鼠相比出现典型的自发痛行为表现。LBP组的小鼠I相痛和模型组相比没有出现差异，但在II相痛15～25 min期间，每5 min舔足和抬足时间显著降低，与模型组相比，具有显著性差异(P<0.05)(图2)，证明枸杞多糖对于福尔马林炎症痛引起的II相痛的确具有良好的缓解作用。对照组(Ctr)小鼠未进行任何处理，用于证明福尔马林模型的稳定性。

图2 LBP对福尔马林炎症痛模型小鼠的镇痛作用Fig.2 Analgesic effect of LBP on formalin induced inflammatory pain in mice 注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05 LBP组与模型组比较。Note:***P<0.001,**P<0.01 and *P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.3 LBP缓解福尔马林诱发的炎症表现

注射福尔马林4 h后将小鼠脱臼处死，称取其两侧后足重量并进行比较，结果显示，三组小鼠左后足质量均无差异，而模型组小鼠的两后足重量差与正常对照组相比增加，具有显著性差异(P<0.001)，LBP组小鼠的两后足重量差与模型组相比有所减少，具有显著性差异(P<0.001)(图3)。

图3 LBP对福尔马林注射足重量的影响Fig.3 Effect of LBP on foot weight of formalin injected mice 注：NS代表三组相比无显著性差异；***P<0.001模型组和空白对照组相比；###P<0.001LBP组与模型组比较。Note:NS showed no significant difference between the three groups;***P<0.001 model control group and blank control group were compared;###P<0.001 LBP group and model control group were compared.

2.4 LBP降低福尔马林引起的炎症因子释放

注射福尔马林4 h后，取外周血液及脊髓组织并检测其中的IL-6含量。结果显示模型组小鼠的血清中和脊髓组织中的IL-6的含量均显著增加，与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.001)，而LBP组小鼠的血清及脊髓组织IL-6含量升高程度明显受到抑制，与模型组相比，具有统计学差异(P<0.001、P<0.05)(图4)，提示LBP能够同时降低外周和神经中枢内的炎症因子释放。

图4 LBP对小鼠组织中IL-6含量的影响Fig.4 Effect of LBP on the content of IL-6 in mouse tissues注：***P<0.001，**P<0.01模型组与空白对照组相比；###P<0.001，#P<0.05LBP组与模型组相比。Note:***P<0.001,**P<0.01 model control group was compared with blank control group;###P<0.001 and #P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.5 LBP降低TRPV1的功能活性

LBP 80 μg/mL预处理原代培养的DRG神经元6 h，进行钙成像实验，结果显示，LBP显著降低了1 μM辣椒素刺激所引起的钙信号增加现象，加入辣椒素后0～1 min内钙信号具有统计学差异，说明LBP减弱了离子通道TRPV1的功能活性(图5)。

图5 LBP降低DRG神经元上TRPV1功能活性Fig.5 LBP reduces TRPV1 functional activity on DRG neurons 注：*P<0.05LBP组与生理盐水对照组比较。Note:*P<0.05 LBP group was compared with saline control group.

3 讨论

疼痛不仅是一个世界范畴的医学问题，也是目前在人群中普遍存在的健康问题之一。疼痛的研究机制不明，现有药物有各自的副作用或欠佳的疗效，迄今为止临床上并无有效特异的治疗方法。多种生物的活性物质都有减轻炎症甚至缓解炎症痛的效果，但相关分子机制研究却少之又少，很大程度限制了天然消炎镇痛药物的临床应用。本实验结果一方面通过在体实验中大鼠足部肿胀程度和血清中IL-6含量两种指标进一步验证了LBP的外周抗炎作用。另一方面值得注意的是，LBP显著降低了福尔马林诱导的II相痛，但对于I相痛没有明显影响，用在体实验证明了LBP在此模型中的直接镇痛作用。由于II相痛与痛觉传导途径中的外周敏化和中枢敏化机制关系密切，即痛觉传入神经元的外周端和脊髓水平的神经元可塑性有关，多种痛觉相关信号分子都参与其中，据此，LBP对II相痛的抑制很可能通过影响神经系统痛觉敏化信号通路来实现。

组织损伤后多种炎症因子、致炎物质等参与到痛觉敏化过程中，其中IL-6是一类前炎症因子，被报道通过增强感觉神经元反应而与痛觉可塑性有密切联系[6]，并且参与到痛觉敏化和中枢敏化的过程中[7]。瞬时电压感受器阳离子通道，子类V，成员1(Transient receptor potential cation channel，subfamily V， member 1，TRPV1)是痛觉敏化过程中重要的离子通道，在骨癌痛模型中，外周或中枢的IL-6均能够通过 JAK/PI3K 信号途径增强外周神经元DRG细胞膜上TRPV1的功能活性[8]。因此，本实验中LBP的抗炎症痛机制可能与降低IL-6，进一步降低了IL-6引起的TRPV1功能上调有关。我们的钙成像实验结果表明，在原代培养的混有胶质细胞的DRG细胞中，LBP预处理的确降低了TRPV1介导的钙离子信号(图5)，与上述结论相符。目前，枸杞多糖的抗炎作用已被公认，但多数停留在体外实验，并且关于LBP是否具有直接的镇痛作用尚无明确实验证实，本论文通过福尔马林炎症实验模型证明LBP的确具有一定的抗炎和镇痛作用，并初步发现该镇痛作用机制除了与外周抗炎途径有关之外，也可能通过直接影响疼痛的神经传导通路来实现。由于炎症痛分子机制十分复杂，有关LBP进一步的抗炎症痛效应和机制仍需要更进一步的研究。

致谢:感谢北京大学医学部王韵教授课题组及北京大学医学部神经科学研究所为本研究提供原代神经元培养实验及钙成像实验平台。