接种不同AM真菌对滇重楼幼苗功能基因表达的影响

张 华，杜慧慧，郭冬琴，杨 敏，汪茂佳，周 浓,*

1重庆三峡学院生物与食品工程学院 三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120；2大理大学药学与化学学院，大理 671000

滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)作为国家二级濒危药用植物，在我国西部药用植物中占主要地位，其多以云南、四川、重庆、贵州、广西等省市最为丰富[1-3]。随着市场需求的不断扩大，而滇重楼自然繁殖率较低、生长周期较长，以及人们的肆意乱挖乱采，严重破坏了其生存环境，使得滇重楼的野生资源蕴藏量急剧下降。

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal,AM)真菌可以促进宿主对土壤营养物质的吸收、促进植物移栽成活率、提高植物抗病能力、产量和品质、调节植物种群和群落结构以及维持生态系统稳定性[4,5]。药用植物的次生代谢产物是特定的基因型和特定的生境共同作用的产物[6]。重楼中含有丰富的三萜皂苷类等次级代谢化合物[7]。研究表明,鲨烯环氧酶基因(Squaleneepoxidase，SE)在调控碳流流向初级代谢或次级代谢中起到关键作用，是植物甾醇、三萜类化合物生物合成的关键酶[8]，其微小的改变即可引起下游产物的大幅变化[9]。此外，AM 菌根共生早期信号途径中涉及关键的基因包括共生受体样蛋白激酶基因(Symbiosisreceptor-likekinase，SYMRK)，产生钙离子振荡的通道蛋白基因(Doesn’tmakingfections1，DMI1) 和钙/钙调依赖性蛋白激酶基因(Calcium/calmodulin-dependentproteinkinase，CCaMK)，这些基因所编码的蛋白对于植物识别和应答 AM 真菌早期信号途径中是必需的[10-12]。与其他药用植物相比，滇重楼的遗传背景信息较少，研究AM菌根共生影响其相关产物基因表达对于获取和利用药用植物有效活性成分具有重要的意义。前期研究发现，接种AM真菌能提高滇重楼根茎中甾体皂苷的含量[13]。因此本研究拟采用实时荧光定量PCR技术分析上述4种功能 基因的表达水平，研究不同AM真菌对这四个基因的表达效果的影响，以期寻找优势AM真菌，对于更好地保护和利用滇重楼资源具有理论和现实意义。

1 材料和方法

1.1 供试AM真菌

本试验所用AM真菌通过美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心(INVAM)购得相应AM真菌纯净菌剂，接种菌剂为带有孢子、菌丝的栽培基质(见表1)。

表1 不同处理组及其接种AM真菌

续表1(Continued Tab.1)

处理组GroupAM fungiAM真菌处理组GroupAM fungiAM真菌SdeSeptoglomus deserticola沙荒球囊霉AleAmbispora leptoticha薄壁两性囊霉SviS.viscosum黏质球囊霉AtrArchaeospora trappei崔氏原囊霉FmFunneliformis mosseae摩西球囊霉CKCK groups对照组CcClaroideoglomus claroideum近明球囊霉

1.2 滇重楼种子

滇重楼的新鲜种子于2012年10月18日采自大理州农业科学推广研究院种植基地的滇重楼健壮植株，常温下河沙贮存4个月，并经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科植物滇重楼P.polyphyllavar.yunnanensis的成熟种子，种子采用单株保存、保证种质资源的稳定性和均一性。

1.3 试剂与仪器

SGTriEx 高纯总RNA提取试剂盒(# R1002)，Thermo First cDNA Synthesis Kit(# Q1010)，2×SG PCR MasterMix(# Q1009)，2×SG Green qPCR Mix(with ROX)(# Q1002)(SinoGene公司，中国)；DNase I，RNase-free(Fermentas公司，加拿大)；3K15型冷冻离心机(Sigma公司，美国)；JY-SPFT型电泳槽和JY300C型电泳仪和JY04S-3C型凝胶成像系统(北京君意东方电泳设备有限公司，中国)；Biophotometer型分光光度计(Eppendorf公司，德国)，StepOnePLUS型定量PCR(Applied Biosystems公司，美国)。

1.4 实验设计

栽培基质为重庆三峡学院百安校区的菜园土与河沙的混合物(体积比3∶1，过2 mm筛，121 ℃高压灭菌锅内灭菌2 h)。采用室温盆栽方法，设AM(接种28种AM真菌)组和CK(对照)组共29种处理。每处理6个重复，每盆栽种滇重楼15株。将栽培袋用10%次氯酸钠溶液消毒15 min后，并用流水清洗干净。

1.5 总RNA提取、反转录cDNA

在同一接种框内，采用5点法取重楼1年生幼苗，每个点取5～10株混合为一个样品，平行3份，快速洗净泥土，用液氮速冻，存放于-80℃冰箱。按照SGTriEx高纯总RNA提取试剂盒说明书提取29组样品。利用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。经Thermo First cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录为cDNA后,以适量的 cDNA 为模板进行荧光定量PCR反应。

1.6 实时荧光定量PCR

以适量的cDNA为模板，在荧光定量PCR仪(Applied Biosystems Step One PLUS)上分析滇重楼甾体皂苷合成关键酶：鲨烯环氧酶(SE)；滇重楼与AM真菌共生相关基因：共生受体样蛋白激酶(SYMRK)，钙/钙调依赖性蛋白激酶(CCaMK)以及离子通道(ion channel)蛋白(DMI1)4个功能基因的相对表达量，以Actin为内参，所用基因的引物见表2。采用比较Ct方法计算，每处理组重复3次。

荧光定量PCR的反应体系为15 μL：2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，上下游引物各0.25 μL，cDNA 2 μL,nuclease-free water 6 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，cycle 40，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

表2 所用基因的引物

1.7 数据处理

使用GraphPad Prism 6软件作图及进行多样本间的单因素方差分析，P< 0.05 为显著性差异，P< 0.01 为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 滇重楼幼苗总RNA浓度与纯度分析

所提取的28种AM真菌处理组和CK组滇重楼幼苗的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳和Biophotometer分光光度计检测。完整的RNA是有28SrRNA和18SrRNA及5SrRNA 3条带。如图1所示，18SrRNA和28SrRNA的电泳条带完整和清晰，含量大约2∶1，说明获得的总RNA没有发生降解。分光光度计检测发现，所有的总RNA的吸光光谱曲线平滑， OD260/OD280的比值在1.88～2.1之间，浓度最高为337.8 ng/μL。因此，所获得的滇重楼幼苗的总RNA能够用于后续的实验。

图1 不同AM真菌处理组和CK组滇重楼幼苗总RNA电泳图Fig.1 The total RNA electrophoretogram of Paris polyphylla var.yunnanens is inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species

2.2 接种不同AM真菌 SE在滇重楼幼苗中表达差异

通过荧光定量PCR结果分析发现，Po组，Ale组和Atr组能极显著地提高SE基因在滇重楼幼苗中的表达量，其P<0.01(如图2所示)，而其余各组并不能提高该基因的表达量。鲨烯环氧酶(SE)的活性决定了环氧化鲨烯生物合成的效率，也会影响以环氧化鲨烯为前体的甾体皂苷等化合物的生物合成。根据本课题组前期研究发现，滇重楼的幼苗根茎中以重楼皂苷Ⅶ含量最高，其次是重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅱ，重楼皂苷Ⅰ的含量最低；并且发现Po组，Ale组和Atr组的重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅵ均能高于CK组[14]。与本实验的结果一致，Po组，Ale组和Atr组中SE基因的表达量与CK组呈显著性上升。推测SE基因被Po，Ale和Atr诱导而高表达时重楼皂苷的含量也会增加。因此，不同的AM真菌能够影响滇重楼幼苗中SE基因的表达差异，从而影响重楼皂苷成分的合成，最终影响滇重楼的品质。

图2 接种不同AM真菌 SE在滇重楼幼苗中的相对表达量Fig.2 The relative expression levels of SE in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：数据经独立样本的T检验*和**分别表示P<0.05和P<0.01的差异显著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.3 接种不同AM真菌SYMRK在滇重楼幼苗中表达差异

在接种28株AM真菌处理后的滇重楼幼苗中，SYMRK基因的表达出现明显的差异，其中除了Spe组，Ale组和Atr组能够提高该基因在滇重楼幼苗的表达情况。Spe组中SYMRK基因的表达量显著上升(P<0.05)，Ale组和Atr组能诱导SYMRK基因高量表达，且呈极显著的趋势(P<0.01)，而其余的AM真菌的处理组中均不能增加SYMRK基因的表达量，如图3所示。前期研究发现，Spe组、Ale组和Atr组能够不同程度的侵染滇重楼并形成菌根。因此，加入Spe、Ale和Atr能够增加滇重楼幼苗菌根生活力，并能够与滇重楼幼苗根系形成良好的互惠共生的关系，促进其幼苗的生长发育。

图3 接种不同AM真菌 SYMRK在滇重楼幼苗中的相对表达量Fig.3 The relative expression levels of SYMRK in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：数据经独立样本的T检验*和**分别表示P<0.05和P<0.01的差异显著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.4 接种不同AM真菌CCaMK在滇重楼幼苗中表达差异

根据荧光定量PCR结果分析发现，Ale组(P<0.05)和Atr组(P<0.01)能够显著性的提高CCaMK基因的表达量，而其余AM真菌组中该基因的表达量均出现不同程度的下降，如图4所示。CCaMK基因可解码Ca2+信号，从而引起共生体效应因子的活性。在接种外源AM真菌的初级阶段，真菌等微生物共生体能够引起Ca2+的变化，从而引起丛枝菌根和共生体系侵染植物根部的细胞信号转导，引发一系列的生理变化。因此，CCaMK在这些过程中扮演着非常关键的角色，外源Ale和Atr可增加该基因的表达量，且能够促进对滇重楼的侵染率，推测能够在滇重楼的生长发育和品质发挥重要的作用。

图4 接种不同AM真菌 CCaMK在滇重楼幼苗中的相对表达量Fig.4 The relative expression levels of CCaMK in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：数据经独立样本的T检验*和**分别表示P<0.05和P<0.01的差异显著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.5 接种不同AM真菌DMI1在滇重楼幼苗中表达差异

离子通道蛋白基因DMI1能够编码阳离子通道蛋白，调节细胞核内外的离子流，对共生信号的传导具有重要的作用。通过荧光定量PCR结果分析可知，Asc、Rfu、Ec、Rcl、Rin、Ale和Atr能够显著性的增加DMI1的表达量，且有些组能够极显著的增加(图5所示)。说明接种不同AM真菌DMI1基因在滇重楼幼苗中表达增加，从而能够介导植物与AM真菌和其他微生物之间的共生关系的建立。

图5 接种不同AM真菌 DMI1在滇重楼幼苗中的相对表达量Fig.5 The relative expression levels of DMI1 in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：数据经独立样本的T检验*和**分别表示P<0.05和P<0.01的差异显著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

3 结论

野生重楼资源缺乏，重楼块根生长缓慢，以及种植周期长和育苗存在问题等等，在很大程度上影响了重楼商品化种植和品质的提高[15]。因此，筛选滇重楼优势菌株，提高滇重楼的产量是丞待解决的首要问题。AM真菌与植物之间具有一种普遍的共生现象，其中80%以上的陆生高等植物能与AM真菌形成共生体[16]，同时作为重要的药用植物根系与土壤菌根真菌的互惠共生体，可以显著提高药用植物的产量和品质[17,18]。已有研究表明，多种AM真菌均可以促进滇重楼成年植株根茎次生代谢产物的形成，且不同AM真菌对滇重楼根茎中不同甾体皂苷的影响不尽相同[18,19]。重楼的主要有效成分是甾体皂苷，鲨烯环氧酶(SE)作为甲羟戊酸途径的关键酶之一，该基因有助于调控活性物质的合成从而提高产量。研究发现SE是控制人参皂苷的生物合成的关键酶之一[20]，本研究发现接种外源AM真菌(Ale和Atr)共培养的滇重楼幼苗可以提高SE的表达量，从而可以促进滇重楼的品质。

作为植物识别菌根真菌诱导而产生的特异分子的共生受体样蛋白激酶(SYMRK)是控制共生形成的关键组分。AM真菌感染植物后会诱导共生基因的表达，而目前SYMRK在豆科植物中研究的较为清楚，但在非豆科植物尤其是药用植物中的功能分析研究较少，本研究以接种不同AM真菌对SYMRK在滇重楼幼苗中的表达差异性研究，为该基因在药用植物中的研究奠定了良好的理论基础。

本研究主要分析4种功能基因的表达差异，为进一步研究重楼皂苷合成的代谢机制和利用次生代谢工程技术提高重楼的品质奠定了分子基础。后期可继续研究4个功能基因在接种外源AM真菌与滇重楼幼苗共培养后的不同组织中的差异表达情况，尽可能阐明滇重楼有效成分合成及调控机制。根据本课题组前期研究发现，接种本研究的28株AM真菌能够使滇重楼幼苗的化学成分发生变化，能够影响滇重楼幼苗菌根生活力、根茎生物量和重楼皂苷产量，结合本研究发现的Ale和Atr两种真菌能够显著提高4种功能基因的表达量。综上所述，建议滇重楼种子共生萌发时可接种薄壁两性囊霉Ambisporaleptoticha(Ale)和崔氏原囊霉Archaeosporatrappei(Atr)，进一步提高滇重楼幼苗的成活率和提高产量，为滇重楼的药用价值奠定良好的基础。结合后续优势菌株的筛选，并与之进行组合回接，以期能提高滇重楼的生长发育和在恶劣环境中的存活能力，从而为滇重楼育苗生产上带来巨大的经济效益。