基于高速逆流色谱的大极性海参多肽分离方法研究

全凯军，段文达，王 玉，裴 栋，黄新异*，邸多隆*

1中国科学院兰州化学物理研究所 西北特色植物资源化学实验室，兰州 740000；2中国科学院大学，北京 100049

海参多肽(Sea cucumber polypeptide)是以海参为原料，经蛋白酶酶解后分离得到的具有多种功能特性的生物活性物质。研究发现海参多肽具有抗氧化[1]、降血压[2]、降血脂[3]、抗疲劳[4]、抗癌[5]以及镇痛[6]等生物活性，在食品、医药、保健品等行业具有很大的应用价值。但海参多肽活性的研究多以混合肽为研究对象，存在生物活性物质基础不明确的问题。目前对海参多肽的分离纯化主要是对其进行脱盐和脱色处理得到纯度较高的粗多肽[7,8]和使用不同技术从分子量角度进行分离纯化得到具有高纯度的多肽单体[9]。上述分离技术使得海参的营养价值得到更好地研究和应用，但依然存在分离不系统、微量活性成分易丢失、制备量小等问题，这就限制了它的进一步开发利用，因此急需建立一种新的方法实现对海参多肽较系统地分段处理，为海参多肽生物活性物质基础研究和系统分离提供技术支持。

高速逆流色谱(High speed counter-current chromatography，HSCCC) 是在液-液分配基础上建立的一种连续的分配色谱技术，与其他柱色谱技术相比，具有无不可逆吸附、无分解变性、活性保留、制备量大和溶剂系统选择多等优点[10]，被作为一门高效的制备或半制备分离技术广泛用于天然产物活性物质的制备分离[11-13]。应用逆流色谱技术对多肽分离研究也已有众多报道[14-16]，但上述研究主要是采用特定逆流色谱设备用双水相体系或使用特别的逆流色谱技术如PH区带精制逆流色谱[17]、螺旋柱逆流色谱[18]等进行单肽的分离制备或对多肽标准品进行方法学研究，而使用HSCCC对多肽粗品进行系统分段的研究却鲜有报道。此外，目前使用最广泛的高速逆流色谱，又叫J型逆流色谱[19]，是建立在一种特殊的同步行星式运动模式基础上能够实现对常规中小极性天然物质的快速、高效分离，但由于其运动模式的限制，对适合多肽分离的大极性溶剂体系如双水相很难得到有效保留，因此对多肽等大极性化合物分离效果不佳，这就极大限制了高速逆流色谱技术在大极性物质如多肽的系统分离和活性筛查研究中的应用[20]。

本文通过对28种逆流色谱中常用的HEMWat溶剂体系极性规律进行分析，探讨了无法用J型HSCCC实现对大极性多肽有效分离的原因，进而建立一种基于分离物质理化性质选择适宜的溶剂改性剂实现对大极性分离物质有效分段的样品前处理方法，并对海参多肽样品进了分段研究，为海参多肽的最佳活性物质的筛选追踪和进一步的开发利用提供了技术支持，同时也为使用HSCCC实现其他大极性物质如蛋白质多糖的分离提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

TBE-300C型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司,中国)；NU3000紫外检测器和NP7000 恒流泵(江苏汉邦科技有限公司，中国)；Easy Chrom工作站(江苏汉邦科技有限公司，中国)；HX-2050 恒温循环器 (北京博医康实验仪器有限公司，中国)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司，瑞士)。1260 HPLC色谱仪(安捷伦科技有限公司，美国)，色谱柱为：Spherisorb C18(4.6 mm×250 mm,5 um,柱号：E2721217)。表1和表2中所列的HEMWat溶剂体系的配比数据是由英国Dynamic Extractions 有限公司提供。

1.1.2 试剂

高速逆流色谱分离所用到的试剂包括：分析级正丁醇(重庆化学试剂有限公司)；超纯水是由Spring-R10水纯化系统(中国厦门科学仪器有限公司)制备得到；分析纯乙酸和三乙胺(天津大茂化学式剂厂)；实验所用海参多肽由青岛市资源化学与新材料研究中心提供，分子量范围在800～3 000 Da。

1.2 HEMWat溶剂体系极性分析

HEMWat溶剂体系是逆流色谱中一类比较有代表性的溶剂体系，其溶剂组成如表1所示。为实现溶剂系统的科学配置,DE研发团队利用气相色谱分离分析技术对HEMWat溶剂体系分层后的组成进行了研究，建立了一套多元溶剂体系上下相体系的科学配制新方法，其组成情况如表2所示。本文根据罗氏极性公式：P=X1P1+X2P2+X3P3+…+XnPn，以Rohrschneider Snyder为极性参数(表3)对HEMWat溶剂体系28个不同组成的两相溶剂系统整体和单相极性分别进行计算并对其规律进行分析。

续表1(Continued Tab.1)

序号No.正己烷Hexane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water序号No.正己烷Heptane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water97.1442.867.140.0042.862340.0010.0040.000.0010.00108.3341.678.330.0041.672441.678.3341.670.008.331110.040.0010.000.0040.002542.867.1442.860.007.141212.537.5012.500.0037.502645.005.0045.000.005.001314.2935.7114.290.0035.712747.502.5047.500.002.501416.6733.3316.670.0033.332850.000.0050.000.000.00

表2 HEMWat各溶剂体系中每种组分的组成比例

表3 HEMWat体系中各溶剂的Rohrschneider Snyder极性值

1.3 改性试剂的确定和优化

改性剂的选择是通过分析海参多肽的理化性质，选择能够影响其分子存在形式的物质作为潜在改性剂。以能够模拟有机相的正丁醇/乙酸乙酯/水(5∶2∶1)为测试溶剂，在多个10 mL透明玻璃试管中分别加入6 mL测试溶剂和2 mg海参多肽粗品，然后逐一加入1 mL备选改性剂，观察海参多肽粗品在测试液中的溶解情况,原理如图1 所示，能够促进样品在测试溶剂中溶解的改性剂即为适宜的改性剂。

图1 改性试剂的筛选原理图Fig.1 The schematic of screening the solvent modifier

1.4 分离条件的确定

本论文的目的在于建立一个基于溶剂改性剂快速筛选策略使用J型高速逆流色谱对大极性海参多肽按照极性差异进行系统分段的样品前处理技术，且此类大极性化合物的K值的准确测定本身存在技术难题，因此直接选择极性溶剂系统水/正丁醇为基准体系，以固定相保留率为首要判断指标，对水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三个溶剂系统进行分离测试筛选，使用筛选后的最优溶剂系统对流速(4、8、10、20 mL/min)进行优化。

1.5 酸碱交替分离

多肽是由不同氨基酸组成，因此由成百上千多肽组成的混合肽不会仅具有单一的酸碱性。1.3中描述的筛选方法是根据混合肽整体表现出来的性质去选择适宜的添加剂，如海参粗多肽由于整体显酸性因此选择乙酸作为改性剂，但其中有部分化合物是显碱性的，在加入乙酸的性溶剂系统中以解离形式存在，趋向与溶解在下相中被优先洗脱出来，形成一个还有较多显碱性肽的混合组份，因此可通过选择极性稍大的溶剂系统，改用碱性三乙胺作为改性剂对由第一步分离获得的第一个极性段进行二次分离，由于三乙胺的加入可使它们以分子形式存在，促进其在有机相中的分配，从而实现二次分离，两步综合即为酸碱交替分离。

1.5 HSCCC所得组份HPLC分析

对经HSCCC分离所得到的各组分进行HPLC分析，色谱条件如下：流动相A为含有0.1%三氟乙酸水溶液，B为色谱乙腈；梯度洗脱： 0～10 min,10～30% B ；10～20 min,30%B;流速1.0 mL/min;检测波长:220 nm和 280 nm;进样体积:20 μL。

2 结果与分析

2.1 HEMWat溶剂体系极性分析

根据1.2方法，使用罗氏极性公式对28个HEMWat溶剂系统的整体极性和单相极性分别进行计算，结果如图2所示：28个溶剂系统分层后的单相极性与整体极性保持相同的变化趋势，如图2A所示。以Rohrschneider Snyder极性参数的计算结果显示：此体系中上相极性范围：0.22～4.75，下相极性范围：下相：4.93～9.74。通过用下相极性减去上相极性得：28个溶剂系统上下相极性差值基本一致(约为5左右)，如图2B所示，也就是说逆流色谱溶剂系统分层后上下相极性具有一个相对稳定的差值，这也是两相能够分层的一个必要条件。

2.2 改性试剂的筛选依据和结果

逆流色谱能够实现有效的首要前提是分离物质在所选溶剂系统的上下相中产生适宜的分配(即0.5

图2 HEMWat溶剂体系极性分析结果及其分布规律Fig.2 The polarity result of the HEMWat solvent systems and its distributing characteristies

2.3 分离条件的确定

实验发现TBE-300C对水/正丁醇体系的保留能力不佳，这是由于正丁醇粘度较高且易与水产生乳化，因此导致固定相的保留不稳定且平衡后色谱峰基线波动较大，尤其在较高流速下固定相保留更差。因此在兼顾分离效果的基础上重点考虑固定相的保留，对水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三个溶剂系统和4、8、10、20 mL/min四个流速进行测试，最终选择水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶3∶2)为基础溶剂系统，4 mL/min为分离流速，此时固定相保留率可达到55%～60%。需要说明的是，4 mL/min的流速未能发挥TBE-300C分离快速的优势，但多肽化合物极性较大，出峰时间较快，总分离时间均在1小时内，因此可以接受。第一步分离最终色谱条件为：水/正丁醇/乙酸乙酯/乙酸(5∶3∶2∶0.5)溶剂系统上相为固定相，下相为流动相；仪器转速为900 rpm,流速为 4 mL/min，由头到尾洗脱，检测波长为220 nm,进样体积为10 mL,样品浓度为 5 mg/mL。因第一步分离所得M是最先洗脱出的组份极性较大，因此在对其进行二次分离时选择极性更大的水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)为溶剂系统用于该组分的分离，其他条件同第一步分离。

2.4 海参多肽分段结果

由图3 A可知，通过第一步分离，可将海参多肽样品分为4个组份(M、1、2 、3,280 nm下)，其中M组份还存在明显的肩峰，表明其还存在进一分离的可能性，因此在以水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)为溶剂系统对M组份进行二次分离，由于三乙胺的加入，使原来部分具有碱性物质的以分子形式存在，促进了其在上相中的分配，经此次分离，由M组份中进一步得到5个组份，如图3 B所示。因此，通过酸碱改性剂的交替加入，通过两步分离，成功将海参多肽粗品细化为8个具有不同极性的片段。各片段HPLC分析结果如图4所示，各组分的保留时间和组成都存在差异。HSCCC和HPLC是基于不同的分离机理，HSCCC是按照极性顺序洗脱，而HPLC则是存在复杂的机理，因此在HPLC保留时间接近的化合物极性也可能存在差异，因此HSCCC与制备型HPLC可以正交用于物质的系统分离。此外，所分离得到的所有组份经茚三酮显色反应鉴定，各组分经茚三酮显色后均出现紫色斑点，判断含有多肽样品。

图3 海参多肽样品酸碱交替洗脱分离结果的逆流色谱图谱Fig.3 The HSCCC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

图4 海参多肽样品经HSCCC分段后各组份HPLC图谱Fig.4 The HPLC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

3 结论

本文通过对逆流色谱溶剂系统极性分布规律的研究，得出无法用J型高速逆流色谱对大极性物质实现有效分离的原因是：(1)J型高速逆流色谱由于运动模式受限对适宜多肽分离的双水相体系保留太差；(2)对于能够保留的常规溶剂体系，大极性化合物几乎单一的分配到溶剂系统下相，难以满足逆流色谱分离所要求的分离物质在两相中分配合理(即0.5