玫瑰色微球菌A-04的红色素鉴定及稳定性分析

邓振山，占 鹏，张 袭

延安大学生命科学学院，延安 716000

天然色素广泛存在于多种生物体内，植物、动物以及一些微生物是主要来源[1]。天然色素开发是当前色素发展的一个重要趋势，很多天然色素具有无毒、安全性高、色调自然、营养价值高和具有药理保健功能等优点[2]。目前天然色素的获得主要有3条途径：天然产物提取、化学人工合成和生物技术生产，但前两者受到资源和环境等因素的制约较大。近年来随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然色素为人们开辟了广阔的领域，而微生物生产天然色素更具有重要的研究与应用价值[3]。通过微生物资源发酵生产红曲色素、类胡萝卜素等多种天然色素已成为现实[2,4]，但其远不能满足各种食品、工业发展的需要。微生物色素作为一种天然、绿色、安全的色素资源十分具有研究价值，因此，从自然资源中筛选具有产天然色素能力的微生物，开发新品种的天然色素，尤其是具有药用价值的天然色素，具有广阔的前景[1,2]。

由于化学合成类胡萝卜素因合成时无法控制其异构体，具有一定毒性而使其应用受到限制[5]。微生物合成具有生物活性的类胡萝卜素因其高效和易于操控正受到广泛关注[6]。罗金亮[7]等筛选了一株类胡萝卜素高产菌，对其进行了形态、生理生化特征、类胡萝卜素产量、分子生物学特征等研究。肖亦农[8]等对不同的色素提取方法进行了研究比较，并认为超声波浸提法提取类胡萝卜素效果最好。刘军[6]等对其分离的红色素产生菌进行了鉴定和色素稳定性试验，并未研究色素种类。但以前文献关于环境因素对色素稳定性的影响研究，主要集中在单因素分析方面，而多因素的交互作用对色素稳定性的研究鲜有报道。鉴于此，本文以本实验室保藏并鉴定过的1株产红色色素的玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus) A-04菌株为研究材料，对其红色色素进行了分离和初步鉴定，并进一步探讨了色素对不同环境因素的耐受性以及环境因素之间的交互作用对色素稳定性的影响，以期为食用色素的应用和产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株玫瑰色微球菌(MicrococcusroseusA-04) 分离自陕北某采油厂的石油污染土壤和水样，由本实验室鉴定并保存。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨 10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.0～7.5。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 10 g，(NH4)2SO42.5 g，KH2PO410 g，Na2HPO44.0 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH调节至7.0。

1.1.3 仪器设备

UV-300紫外-可见分光光度仪，日本岛津公司；VHX-6000 数码显微系统，基恩士 (中国) 有限公司； R-100 旋转蒸发仪，上海秦高实业有限公司；ZF-200暗箱式紫外分析仪，上海速科实业有限公司；LC-2010AHT高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 色素的分离和纯化

将玫瑰色微球菌A-04在牛肉膏蛋白胨培养基活化培养后，配置成2 mL/L的菌悬液，接种至发酵培养基，25 ℃，160 rpm摇床培养5 天后，取发酵液在5 000 rpm离心5 min。收集上层色素相，取无水乙醇缓慢加入色素液，并不断摇动，使两溶液充分混匀，直至有白色絮状物出现，停止加入乙醇。静置至混合液分层，取下层色素相用氯仿萃取2次，合并氯仿相，于40 ℃旋转蒸发仪浓缩，得红色粘稠的色素粗品，室温保藏备用。

以硅胶(柱层析用)和石油醚装柱(湿法)，取少量色素样品用洗脱剂(氯仿∶甲醇=8∶1)溶解后加到色谱柱上，添加洗脱剂至色谱柱以增加柱压。待柱内红色色素带将到达筛板时，收集色素溶液。于40 ℃旋转蒸发仪上蒸干，即为色素纯品。

1.2.2 色素种类初步鉴定

1.2.2.1 色素的显色反应[9,10]

按照文献9和10中描述的方法，采用浓H2SO4显色反应进行色素的鉴定。

1.2.2.2 色素的吸收光波测定

将该色素溶液通过扫描其在300～650 nm的紫外吸收光谱，确定该色素的特征性吸收峰(或最大吸收峰)。

1.2.3 单个环境因素对色素稳定性的影响

设置温度、pH、溶剂、添加剂、金属离子等环境因子(溶剂极性从小到大依次为：石油醚，正丁醇，丙三醇，丙酮；金属离子氧化性从弱到强依次为： K+，Ca2+，Al3+，Mn2+，Zn2+，Fe2+；添加剂的氧化性从弱到强依次为：蔗糖，柠檬酸，苯甲酸，过氧化氢)作为变量，每处理3个重复，探究单个环境因素对色素稳定性的影响[11]。

1.2.3.1 温度对色素的稳定性影响

分别取3 mg/mL色素溶液，分别在60、80、100、120 ℃的避光条件下，每隔1天测定一次溶液吸光值，连续测定5 天。

1.2.3.2 pH对色素的稳定性影响

分别取3 mg/mL色素溶液，调pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，避光保存，半小时后测定溶液吸光值。

1.2.3.3 不同溶剂对色素的稳定性影响

分别用石油醚、正丁醇、丙三醇、丙酮等不同溶剂分别溶解等量色素，至浓度为3 mg/mL，测定其吸光值。

1.2.3.4 添加剂对色素的稳定性影响

分别取3 mg/mL色素溶液，分别按照1、2、3、4、5、6 mL的梯度加入1 mg/mL的蔗糖、苯甲酸、柠檬酸、过氧化氢等添加剂，避光保存，半小时后测定其吸光值。

1.2.3.5 离子的氧化性对色素的稳定性影响

分别取3 mg/mL色素溶液，分别加入KCl、CaCl2、AlCl3、MnCl2、ZnCl2、FeCl2等金属离子，避光保存，半小时后测定其吸光值。

1.2.4 多个环境因子交互作用对色素稳定性的响应面分析

依据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单个环境因子对色素稳定性的影响结果，选取温度、pH和溶剂这3个对色素稳定性影响较大的因素，进一步采用三因素三水平的响应面分析方法[12,13]。

对影响色素稳定性的3个主要因素进行响应面试验设计，因素及水平设置如表1所示：

为了数量化表示溶剂，采用溶剂极性的近似值来代表溶剂。分别为：石油醚(1)、丙三醇(3)、丙酮(5)。

表1响应面试验因素与水平

Table 1 Factors and levels of experiment of response surface analysis

试验因素Factors因素水平Factor levels-101A 温度Temp.6080100B pH468C 溶剂Solvent135

1.2.5 数据分析

利用Excel 2013整理数据，用Origin对“单因素对色素稳定性的影响”部分数据绘图并分析，用Design Expert对“因素间交互作用对色素稳定性的影响”部分数据进行响应面分析法的设计、绘图及分析。

2 结果与分析

2.1 色素种类初步鉴定结果

2.1.1 色素的显色反应鉴定结果

将采用上述的提取方法，从菌体中提取到的含有纯色素的石油醚溶液，倾入装有1～2 mL浓H2SO4的试管中，发现在两相交接处呈青兰色。再将其倾入装有1～2 mL浓HCl的试管中，振荡片刻，下层呈浅兰色。以上试验结果说明样品中含有类胡萝卜素。

2.1.2 色素光谱特征鉴定结果

该色素在300～650 nm范围内有7个吸收峰(见表2)。 其中的特征吸收峰为445.1、459.4、537.1 nm。因类胡萝卜素类物质在400～600 nm之间存在三指吸收峰，因此，证实菌株A-04能够产类胡萝卜素类产物。

表2 波峰检测结果

由表2结果可知，3号峰对应的波长为537 nm，吸收值为0.236，是该色素的最大吸收峰。说明在色素结构正常的情况下，在537 nm的波长下，色素的吸收值最大。

2.2 单个环境因素对色素稳定性的影响

2.2.1 温度对色素稳定性的影响

图1 温度对色素稳定性的影响Fig.1 Effect of temterature on the pigments’ stability

图1表明：相同时间内，温度越高，色素的OD值越小；随着温度升高，即使时间变短，其OD也会变小。这说明在一定温度下，随时间的变长，OD呈下降趋势，但温度较低时趋势并不明显；但当温度较高(超过100 ℃)时，则下降的趋势十分明显。说明60 ℃及稍高的温度对色素结构的破坏并不显著，而100 ℃甚至120 ℃的高温对色素结构的破坏则是显著而快速的。

2.2.2 pH对色素稳定性的影响

由图2显示，色素在中性环境pH5.0～8.0的范围内均表现出较好的耐受能力，证明其能够在较宽泛的pH下依然保持其稳定性。通过三次项曲线拟合还可以得到一条pH6.0为最大值的曲线。证明该色素也存在一个适于使之保持稳定结构的pH范围，该范围大约在pH5～8之间。

图2 pH对色素稳定性的影响Fig.2 Effect of pH on the pigments’ stability

2.2.3 不同溶剂对色素稳定性的影响

由图3结果表明，色素在极性较小的溶剂中吸光值小，即表明色素在极性较小的溶剂中，稳定性小；而在极性较大的溶剂(丙酮)中稳定性大。此结果说明，该色素分子是一种极性较大的物质。

图3 溶剂对色素稳定性的影响Fig.3 Effect of solvent on the pigments’ stability

2.2.4 添加剂对色素稳定性的影响

对图4分析表明：添加剂的氧化性并非是造成吸光值波动的主因，并且同一添加剂，即氧化性相同的情况下，随着添加剂的用量的增多，色素的稳定性只是小幅度地变化。说明在试验范围内(蔗糖、柠檬酸、苯甲酸和过氧化氢)添加剂不能引起色素稳定性出现的显著变化，即不会对色素结构造成较大影响。

2.2.5 金属离子对色素稳定性的影响

对六种金属离子的试验结果表明，分别按照粒子大小、所带电荷、氧化性进行排序，发现只有关于氧化性的排序是有规律可循的。试验结果如图5所示。总体看来，在金属离子氧化性较弱时，色素OD值小；当金属离子氧化性较强时，则色素吸光值变大。这说明金属离子氧化性与色素稳定性呈正相关性。

图4 添加剂对色素稳定性的影响Fig.4 Effect of additives on the pigments’ stability注：z：蔗糖；n：柠檬酸；b：苯甲酸；g：过氧化氢；1：第一组；2：第二组Note:z:Cane sugar;n:Citric acid;b:Benzoic acid;g:Hydrogen peroxide;1:First group;2:Second group

图5 金属离子对色素稳定性的影响Fig.5 Effect of ions on the pigments’ stability

2.3 多个环境因子的响应面分析

2.3.1 方案设计及结果

结合上述试验结果，选择对色素稳定性影响较大的温度(A)、pH(B)、溶剂(C)作为自变量，以色素吸光值为响应值(Y)，进行响应面分析试验。试验方案及结果见表3。

2.3.2 多元二次响应面回归模型的建立与分析

表3的试验结果通过RSA软件进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型：

Y=0.24-0.11×A+0.049×C+0.02×A×C+0.13×A2-0.17×B2+0.049×C2，各因素的方差分析见表4。

由表4结果可知，P值<0.000 1，表明模型极显著，回归模型的决定系数为A(温度)、C(溶剂)、AC(温度与溶剂的交互作用)，它们的Prob>F值分别为< 0.000 1，< 0.000 1，0.033 1，对色素稳定性的影响显著，说明该模型的拟合度较好。

表3 响应面分析方案及试验结果

表4 二次响应面回归模型方差分析

由表4结果可以看出，影响色素稳定性的各因素按影响大小排序依次为A(温度)、C(溶剂)，并且温度和溶剂均达到极显著水平。

由表4的结果分析表明，本试验中AC的交互作用影响显著(见图7)。由图7可知，温度越低，色素稳定性越大，溶剂极性越大，色素稳定性越大，二者交互作用还可以一定程度上提高色素稳定性。这与单因素对色素稳定性影响探究结果是一致的，因为温度的升高使色素分子结构变得不稳定，而溶剂极性增大使色素更好的溶解于相应体系中。

另外，虽然响应面分析指出pH对色素稳定性的影响并不显著，但单因素分析时pH对色素稳定性是有重要影响的。因此，图2中也列出了pH和其它因素的交互作用。分析图6和图8可以发现pH对色素的影响依然是钟形曲线，是非线性的，在与另一个因素的影响曲线复合后形成了马鞍状的三维曲面图形。这说明pH增大的同时，色素OD值是先增大后减小的，因此，pH4～6与pH6～8对色素稳定性有显著影响。这与单因素对色素稳定性的影响探究结果是相同的，因为，该色素分子可能具有最适的pH范围，而增大或减小pH都会使其结构发生改变。

图6 温度和pH交互作用对色素稳定性的影响响应面图Fig.6 Response surface plots showing interactive effects between temperature and pH on the pigments’ stability

图7 温度和溶剂交互作用对色素稳定性的影响响应面图Fig.7 Response surface plots showing interactive effects between temperature and pH on the pigments’ stability

图8 溶剂和pH交互作用对色素稳定性的影响响应面图Fig.8 Response surface plots showing interactive effects between solvent and pH on the pigments’ stability

3 结论

本文通过对玫瑰色微球菌A-04的色素分离和初步鉴定，明确其产生的色素为类胡萝卜素。国内关于微球菌产类胡萝卜素的研究，以前已有文献报道，如袁婀娜等[13]从野外土壤中分离得到1株产类胡萝卜素菌株。根据其形态特征、生理生化特征的测定结果分析，该菌株应归为微球菌属(Micrococcus)玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)。周明辉等[14]的研究结果证实归属于玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)的菌株M1的细胞内含有类胡萝卜素，此结果与前期鉴定及本文产类胡萝卜素的研究结果一致。但本研究发现A-04的类胡萝卜素的吸收光谱与已有的文献报道不同[13,14]，因此，该色素可能是一种新型类胡萝卜素或类胡萝卜素衍生物，色素组分定性有待进一步研究。

刘军[6]等对其分离的红色素产生菌进行了鉴定，并进行了色素稳定性试验，但并未研究色素种类。李彦芹[9]等对光合细菌产生的类胡萝卜素的稳定性进行了研究，认为低温、中性的环境适合类胡萝卜素的存放。而本文研究结果表明色素的存放的最佳条件是在60 ℃以下，而不要在超过80 ℃的条件下持续存放，当处于超过100 ℃的环境则迅速降解，几乎不能使用。色素在pH5～8之间比较稳定，吸光值无较大变化，pH5.5时色素最稳定，pH变酸时稳定性迅速降低，变碱时稳定性降低稍慢。不同极性的溶剂中，极性较大的丙酮对色素稳定性保持更有利。此外，添加剂和金属离子对色素稳定性也表现出小幅的抑制性影响。但目前针对环境因素对色素稳定性的影响的研究，主要仍以单因素分析为主，多因素的交互作用对色素稳定性的研究不足[15]。响应面分析法利用回归分析方法进行函数估算，然后用一次或二次多项式模型将回归因素与试验结果进行拟合，对影响响应值的因子水平及其交互作用进行优化与评价，是一种更为有效合理的试验设计方法。本文通过响应面分析法，克服了正交试验法是线性模型的局限性，在单因素试验的基础上，得出温度(A)、pH(B)和溶剂(C)是影响色素稳定性的主要因素，温度与溶剂的交互作用对色素稳定性的影响也较为明显。在pH维持在5-8之间时，在80 ℃以下范围内，温度越低，同时溶剂的极性越大，越有利于维持色素的稳定。各因素在本次试验范围内，经响应面分析的最佳存放条件是温度60 ℃，pH5.5，丙酮(极性5)溶解。

本文虽然探讨了环境中单因素及多因素的交互作用对色素稳定性的影响，为其实际应用提供了一定的理论依据。但研究缺乏对该菌株所产色素的结构表征及发酵条件的优化，今后还有待于通过各种色谱、光谱、质谱、核磁共振谱来解析该色素分子的结构特征及产色素发酵条件的优化，同时需要增加更多的影响色素稳定性的环境因子，并对其稳定性进行深入的研究，将会有利于提高该色素的实际应用价值。