小麦麸皮水不溶性阿拉伯木聚糖提取及其酶解产物分析

黎 芳，刘 佳，王冉冉，刘必慧，李 冲，易若琨，赵 欣*

（1.重庆第二师范学院 生物与化学工程学院 重庆市功能性食品协同创新中心 重庆市功能性食品工程技术研究中心重庆市功能性食品研发工程实验室，重庆400067；2.重庆第二师范学院 生物与化学工程学院，重庆400067）

小麦麸皮是小麦制粉加工中的主要副产品，具有很高的营养价值，每年产量可达3 000万t以上[1-2]。目前，小麦麸皮很少用于深加工和再利用。小麦麸皮作为面粉厂的大宗副产品，来源充足、价格低廉，若能将其深加工，将具有很高的经济效益和社会效益。

阿拉伯木聚糖（arabinoxylans，AX）作为小麦麸皮中的主要成分，与纤维素、果胶、β-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖等其它多糖共同构成了细胞壁，作为细胞骨架的一部分，维持组织的完整性[3]。根据水溶性的差异可将AX分为水溶性阿拉伯木聚糖和水不溶性阿拉伯木聚糖。其中，水不溶性阿拉伯木聚糖占整个AX含量的80%以上[4-5]。目前主要采用碱法提取水不溶性阿拉伯木聚糖[6-9]，常用的碱有NaOH、Ca（OH）2、Ba（OH）2等。郑学玲[10]采用碱提法对麸皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的提取工艺进行优化得出，提取剂为Ba（OH）2时，提取率较NaOH高；马福民等[11]也采用碱提法对全麦粉中的水不溶性阿拉伯木聚糖的提取工艺进行优化得出，最佳提取工艺条件为料液比1∶188（g∶mL）、提取温度65 ℃、提取时间3 h，提取率为31.87%。在碱性条件下，提取率较高，但会破坏阿拉伯木聚糖结构中如阿魏酸等功能基团。

阿拉伯木聚糖经酶解后得到的阿拉伯低聚木糖（arabinoxylan oligosaccharides，AXOS）为一种新型的益生元，可特异性地促进益生菌的增殖，尤其是对双歧杆菌（Bifidobacterium）增殖作用的效果显著优于果寡糖[12]。因木聚糖来源和木聚糖酶的酶学特性的不同，导致阿拉伯低聚木糖也有差异，如低聚木糖（木二、木三等）、木糖、阿拉伯糖等支链水解产物，因此，有必要对水不溶性阿拉伯木聚糖酶解产物进行研究。

本研究以Ba（OH）2作为碱提剂，采用碱提法对小麦麸皮中水不溶性阿拉伯木聚糖进行提取，以其得率为响应指标，采用响应面分析法对其提取工艺进行优化。以提取的水不溶性阿拉伯木聚糖为底物，选用不同来源及种类的木聚糖酶酶解阿拉伯木聚糖，并采用薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）分析酶解产物中低聚木糖的差异性，以期筛选最适木聚糖酶，为今后阿拉伯低聚木糖的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦：河南农科院；耐高温α-淀粉酶（120 KNU/g）、高转化率糖化酶（300 AGU/mL）、碱性蛋白酶（10 KU/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司；地衣酚、D-木糖、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均为分析纯）：中国医药集团化学试剂有限公司；木糖、木二塘、木三塘、木四糖（纯度均＞95%）：爱尔兰Megazyme公司。

木聚糖酶：分别为A～F，其中A来源于链霉菌（Streptomyces）L10904；B来源于链霉菌L10608，为11家族酶；C来源于链霉菌L10608，为10家族酶；D来源于嗜热踝节菌（Talaromyces thermophilus）F1208；E来源于链霉菌L10904重组酶；F来源于链霉菌L10904改造酶（替换N端部分序列：第一个赖氨酸替换成丙氨酸），具体信息见表1。

表1 木聚糖酶的酶活及最适作用条件Table 1 Enzyme activities and optimum reaction conditions of xylanases

1.2 仪器与设备

I9型紫外可见分光光度计：济南海能仪器股份有限公司；Stuart系列旋转蒸发仪：北京首选科技有限公司；FreeZone-6L冷冻干燥设备：美国Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦麸皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的提取

小麦麸皮的制备：小麦经麸皮分离小麦磨粉机得到粗麸皮，粗麸皮经超微粉碎机粉碎，过40目筛，于4 ℃冰箱储存备用。

水不溶性阿拉伯木聚糖的提取参考文献[13]，并根据实际情况加以调整。

称取水不溶性木聚糖粗提物1.0 g，按一定料液比加入饱和Ba（OH）2碱溶液，在一定温度条件下、150 r/min搅拌，提取结束后调pH值至7.0，离心后取上清液真空浓缩至10 mL，于截留分子质量为10 000 Da的透析膜中进行透析，透析液为高纯水，透析过夜，冷冻干燥，得到水不溶性阿拉伯木聚糖。

1.3.2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化单因素试验

料液比的确定：设定提取温度50 ℃，提取时间2 h，考察料液比（1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250）对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响，其计算公式如下：

采用单因素轮换法依次考察提取时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、提取温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响。

1.3.3 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化响应面分析

在单因素试验的基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）3个因素为自变量，以水不溶性阿拉伯木聚糖得率（Y）为响应值进行3因素3水平的响应面试验。响应面试验因素与水平见表2。

表2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for the extraction process optimization of water insoluble arabinoxylans

1.3.4 分析测定

水不溶性阿拉伯木聚糖含量的测定：采用地衣酚-盐酸法[14]。

蛋白含量的测定：参照GB/T 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[15]中的微量凯氏定氮法。

淀粉含量的测定：参照AOAC 996.11方法用试剂盒进行测定，该方法适用于测定谷物中总淀粉的含量。

水分含量的测定：参照GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[16]。

1.3.5 酶解产物薄层色谱分析

采用不同木聚糖酶（A～F）对最优提取工艺条件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖进行酶解，酶解产物经阴阳离子树脂吸附过夜，以除去样品中的离子，点样于TLC板上，将点好的板放入展开槽内展开两次，吹干，进行显色。所用展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶重蒸水=2∶1∶1（V/V），显色剂为500 mL甲醇与25 mL浓硫酸的混合液。

2 结果与分析

2.1 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化单因素试验结果

2.1.1 料液比对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响

由图1可以看出，随着提取剂体积的增加，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈现先升高后稳定的趋势，这是因为随着提取剂体积的增大，粗提物与提取溶剂接触界面增大，传质速率提高，导致得率增大。当料液比达到1∶150时，水不溶性阿拉伯木聚糖得率达到22.67%。继续增加提取剂体积，水不溶性阿拉伯木聚糖得率趋于稳定。从节约资源，减少环境污染角度考虑，选择最优料液比为1∶150。

图1 料液比对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响Fig. 1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.1.2 提取时间对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响

由图2可以看出，随着提取时间的延长，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈现先增高后稳定的趋势。当提取时间为4 h时，水不溶性阿拉伯木聚糖得率达到27.40%。继续延长提取时间，水不溶性阿拉伯木聚糖得率趋于稳定。因此，最优提取时间为4 h。张晓娜等[17]提取玉米皮中的阿拉伯木聚糖最优提取时间为3 h。

图2 提取时间对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.1.3 提取温度对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响

由图3可以看出，随着提取温度的升高，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈现先增加后减小的趋势。当提取温度达到60℃时，水不溶性阿拉伯木聚糖得率达到最大值，为30.9%。继续提高提取温度后，水不溶性阿拉伯木聚糖得率减小，分析原因可能是随着提取温度的升高，提取剂挥发，同时小麦麸皮中的淀粉易产生糊化现象，从而影响水不溶性阿拉伯木聚糖得率，导致水不溶性阿拉伯木聚糖得率降低。因此，最优提取温度为60 ℃。迟燕平等[18]采用响应面分析法优化米糠中阿拉伯木聚糖提取条件，选择最优提取温度为66 ℃，与本研究的提取温度60 ℃接近。

图3 提取温度对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化响应面试验结果

在单因素试验的基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）3个因素为自变量，水不溶性阿拉伯木聚糖得率（Y）为响应值进行3因素3水平的响应面试验。响应面试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface experiments for the extraction process optimization of water insoluble arabinoxylan

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert软件对表3试验结果进行回归拟合，得到水不溶性阿拉伯木聚糖得率对提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）的二次多项回归方程：Y=50.06+3.02A+5.04B+4.86C-3.10AB+0.80AC+4.28BC-12.07A2-7.34B2-6.14C2。

由表4可知，模型的P值=0.000 3＜0.01，极显著，失拟项P值=0.676 2＞0.05，不显著，说明模型可靠，可用于分析预测水不溶性阿拉伯木聚糖提取工艺的优化程度。3个因素对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响主次顺序为B＞C＞A，即提取时间＞料液比＞提取温度。一次项B、C和二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A及交互项BC对结果影响显著（P＜0.05），交互项AB、AC对结果影响不显著（P＞0.05）。各个因素交互作用的响应面如图4所示。

由图4可知，交互作用BC的响应面存在最高点，响应面呈抛物线型，等高线呈椭圆形，说明交互作用BC对水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影响显著，而其他交互作用影响不显著。

图4 提取温度、提取时间及料液比交互作用对水不溶性阿拉伯木聚糖得率影响的响应面曲线及等高线Fig. 4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature, time and solid to liquid ratio on the yield of water unextractable arabinoxylan

经响应面优化，得到水不溶性阿拉伯木聚糖的最佳提取工艺条件：提取温度61.21 ℃、提取时间4.99 h、料液比1∶193.00（g∶mL），在此优化条件下，水不溶性阿拉伯木聚糖得率达到52.82%。考虑到试验的可操作性，将最佳的提取条件调整为提取温度61 ℃、提取时间5 h、料液比1∶193（g∶mL）。在此最优提取条件下，水不溶性阿拉伯木聚糖得率为51.61%，与理论预测值相差不大。

2.3 提取物中主要成分分析

对最佳提取工艺条件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖的基本成分进行测定，以便进行后期酶解产物分析研究，测定结果如表5所示。

表5 最佳工艺条件下提取物中主要成分的测定Table 5 Determination of main components in the extract at the optimum condition

由表5可知，在最佳提取工艺条件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖含量较高（72.19%），蛋白质（2.09%）及淀粉（0.18%）的含量很低，有利于后期试验研究。张梅红等[19]采用NaOH提取阿拉伯木聚糖，含量为69.67%，说明本研究所得水不溶性阿拉伯木聚糖的纯度相对更高。

2.4 酶解产物的薄层色谱分析

采用不同木聚糖酶（A～F）对水不溶性阿拉伯木聚糖进行酶解，酶解产物进行TLC分析，结果见图5。

由图5可知，不同种类的木聚糖酶对水不溶性阿拉伯木聚糖进行酶解，其酶解产物的种类、含量是不同的，酶解产物以木二糖为主。其中木聚糖酶A的酶解产物种类最多，木聚糖酶D的酶解产物种类相对较少，木聚糖酶D对水不溶性阿拉伯木聚糖的水解率不高，说明该木聚糖酶水解碱提水不溶性阿拉伯木聚糖并不能产生大量的活性低聚糖。有大量研究表明，当不同结构和组成成分的木聚糖与木聚糖酶结合时，由于木聚糖酶空间结构的容纳性，导致结合方式的改变引起产物发生变化[20-21]，从薄层色谱可以看出木聚糖酶A酶解产物种类和含量相对其他木聚糖酶酶解产物种类和含量更多。

图5 不同木聚糖酶酶解产物薄层色谱分析结果Fig. 5 Thin layer chromatography analysis results of enzymatic hydrolyzed products of different xylanases

3 结论

通过单因素试验及响应面试验优化得出小麦麸皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶193（g∶mL）、提取温度61 ℃，提取时间5 h。在此最优提取条件下，水不溶性阿拉伯木聚糖的得率达51.61%。以碱提法提取的水不溶性阿拉伯木聚糖为底物，用不同种类的木聚糖酶（A～F）进行酶解，TLC分析结果表明，链霉菌L10904来源的木聚糖A对碱提法提取的水不溶性阿拉伯木聚糖有较好的底物特异性，酶解产物丰富且酶解产物以木二糖为主，为阿拉伯低聚木糖的制备提供理论依据。