基因工程大肠杆菌BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流研究

黄 聪，李 啸，*，许超群，张小龙，叶 晗，程 奔，伍业旭

（1.三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌443003）

β-甘露聚糖酶是一类能够水解含β-1,4-D-甘露糖苷键的内切水解酶[1]，可以水解葡萄甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖等，广泛存在于自然界中。目前，β-甘露聚糖酶被用于多个领域，包括食品、饲料、医药、造纸、石油开采等领域[2-4]，具有良好的应用前景。

代谢通量分析包括基于物料平衡的代谢通量、基于同位素示踪的代谢通量和基于基因组尺度的代谢通量，是研究代谢工程的一种重要的方法[5]。物料平衡代谢通量分析是基于化学计量系数的研究方法，它根据细胞内所有的生化反应方程式建立数学平衡模型，计算胞内外物质的代谢通量，基于物料平衡的代谢通量已被广泛应用于多项研究[6-9]，然而关于β-甘露聚糖酶的代谢流的研究却鲜有报道[10]。本研究建立并验证了基因工程大肠杆菌（Escherichia coli）BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流模型，分析菌体比生长速率和β-甘露聚糖酶合成通量最大时的极端代谢流分布，并对代谢网络节点（葡糖糖-6-磷酸、丙酮酸）进行分析，为基因工程大肠杆菌BL21产β-甘露聚糖酶的研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

基因工程大肠杆菌BL21（含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168来源的β-甘露聚糖酶基因）：由安琪酵母菌种保藏中心提供，具有氨苄抗性。

1.1.2 培养基

斜面培养基：酵母蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母抽提物5 g，琼脂粉15 g，121 ℃灭菌15 min。

种子培养基[11]：甘油8.00 g，酵母抽提物17.50 g，酵母蛋白胨7.50 g，NaCl 6.00 g，Na2HPO48.50 g，KH2PO44.25 g，K2HPO44.25 g，MgSO41.00 g，pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。

发酵培养基：葡萄糖20.00 g，酵母抽提物13.32 g，Na2HPO·412H2O 17.10 g，KH2PO43.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO40.24 g，微量元素10.00 mL/L，pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。

微量元素[12]：FeCl31.23 g，Na2MoO40.06 g，ZnCl20.36 g，CuCl20.043 g，CaCl20.16 g，CoCl20.06 g，MnCl20.10 g，121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 试剂

氨苄西林钠（分析纯）：中诺药业（石家庄）有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FUS-50 L（A）型新概念发酵罐：上海国强生化工程装备有限公司；PAS7000型生物尾气分析仪：重庆哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D脚踏开门型大容量全温度恒温摇床：上海智城生物科技有限公司；SP-754型紫外可见光分光光度计：上海天普分析仪器有限公司；Chromaster高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

一级种子液：将斜面上的菌种接种至装液量为25 mL的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。

二级种子液：将一级种子液接种至装液量为500 mL的5 L三角瓶中，接种量4%（V/V），于37 ℃、200 r/min条件下培养24 h。

分批发酵：将二级种子液按4%（V/V）的接种量接入新概念发酵罐中，装液量为30 L，转速为200 r/min，通气量1.67 vvm，0.035 MPa条件下发酵培养12 h，第2小时末加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG（过滤灭菌）诱导β-甘露聚糖酶表达。

1.3.2 分析方法

葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法进行测定[13]；菌体浓度：采用分光光度计法测定[14]，细胞干质量由干质量（y）与菌体浓度（x）的回归方程（y=0.441 86x-0.006 34）计算得到；乙酸含量：采用HPLC法测定[15]；β-甘露聚糖酶活力：参考文献[16]。CO2释放速率：由Biostar 1.5在线分析控制系统计算。

t时刻的葡萄糖摄取通量[mmol（/g·h）]、乙酸分泌通量[mmol/（g·h）]、菌体合成通量（h-1）及CO2释放通量[mmol/（g·h）]的计算公式分别见（1）、（2）、（3）、（4）。

1.3.3 模型的构建与运算

ÖZKAN P等[17]已报道了重组大肠杆菌BL21表达外源蛋白质的模型，本研究在其基础上简化合并了部分代谢通路，并将β-甘露聚糖酶的代谢途径加入到简化的代谢网络中，构建了重组大肠杆菌BL21产β-甘露聚糖酶的代谢网络见图1。该代谢网络包括糖酵解（embden-meyerhof-parnas，EMP）途径、戊糖磷酸途径（hexose monophosphate pathway，HMP）、柠檬酸循环（citric acid cycle，TCA）、氨基酸和乙酸合成途径、回补反应、磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS）、菌体合成以及β-甘露聚糖酶的合成途径8个部分，共41个反应（表1），也即41个未知反应通量。

表1 代谢模型的反应式Table 1 Reaction formulas of metabolic model

采用CellNetAnalyzer 2018.1[18]计算代谢通量，将41个反应式输入CellNetAnalyzer，软件显示代谢网络的自由度为3，即需要3个反应通量即可求出所有41个未知通量。在本研究中，选择葡萄糖摄取通量、乙酸分泌通量和菌体合成通量3个外部可测通量，求解整个代谢通量的分布。

2 结果与分析

2.1 模型的验证

为了验证模型的准确性，将葡萄糖摄取通量（r1）、乙酸分泌通量（r25）和菌体合成通量（r41）输入至CellNetAnalyzer，从而获得整个代谢网络每步反应（r1～r41）的代谢通量。通过比较计算获得的CO2释放通量（r35）和实验测定获得的CO2释放通量，验证模型的可靠性。每小时重组菌E.coli BL21分批发酵产生的葡萄糖、乙酸、菌体干质量和CO2释放速率及其代谢通量的测定结果见表2。

表2 部分物质的含量及代谢通量测定结果Table 2 Determined results of concentrations and metabolic fluxes of some substances

由表2可知，重组大肠杆菌BL21分批发酵0～12 h过程中，每个时刻计算得到的CO2释放通量与实验测定的每个时刻CO2释放通量无显著性差异（P＞0.05），即由模型计算得到的CO2释放通量可以准确反映实际CO2释放通量，说明重组大肠杆菌产β-甘露聚糖酶的模型是可靠的，可以被用于大肠杆菌BL21产β-甘露聚糖酶的代谢流分析。

2.2 极端代谢流分布

2.2.1 菌体合成通量最大时的极端代谢流分布

在代谢网络中，由于代谢流的外溢造成底物浪费，降低了底物转化率，所以为了获得最大的菌体合成通量代谢流分布，将r25假设为0，即将乙酰辅酶A转化为乙酸的代谢通量假设为0。同时，令r40=0，也即β-甘露聚糖酶的通量为0，此时，计算得到的通量分布即为菌体合成通量最大时菌体代谢通量的分布。以葡萄糖通量为对照，标准化乙酸分泌和菌体合成通量。计算得到的41个反应的代谢通量，结果如表3所示。

表3 两种极端代谢流分布Table 3 Distributions of two kind of extreme metabolic fluxes

由表3可知，当乙酸分泌通量和β-甘露聚糖酶合成通量均为0时，理论最大菌体合成通量r41为9.39 h-1。此时，流经HMP途径的通量r2为8.62 mmol（/g·h），流经EMP途径的通量r4为91.38 mmol（/g·h），也即8.62%的底物分配到HMP途径，91.38%的底物分配到EMP途径。此外进入TCA循环的流量r11为103.75 mmol（/g·h），但是考虑到葡萄糖经EMP途径进入TCA循环途径时，一分子的葡萄糖会变为为两分子的丙酮酸，所以真实分配到TCA循环途径的底物占初始底物的51.88%。

在生化网络中，EMP途径和TCA循环主要为细胞提供能量和部分前体物质，而HMP途径的生物学意义主要在于提供给细胞还原力和核酸合成前体[19]。根据代谢流分布结果可知，大量的底物被分配到EMP途径和TCA循环进行有氧呼吸，用来产生大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），这说明菌体生长需要大量的ATP供应。只有＜9%的底物被分配到HMP途径，用来产生菌体增殖所必须的还原力和核酸。另外，由于丙酮酸是多种氨基酸生物合成的前体，所以丙酮酸流向TCA循环的流量被分流到氨基酸合成，导致TCA循环途径流量变小。

2.2.2 β-甘露聚糖酶合成通量最大时的极端代谢流分布

为了获得最大β-甘露聚糖酶合成通量，令r25=0且r41=0，也即乙酰辅酶A转化为乙酸的代谢通量和菌体合成通量均为0。以葡萄糖通量为对照，标准化乙酸分泌和菌体合成通量。计算得到的41个反应的代谢通量，结果如表3所示。

由表3可知，当乙酸分泌和菌体合成通量均为0时，理论最大β-甘露聚糖酶合成通量r41为0.18 mmol（/g·h）。此时，流经HMP途径的通量r2为17.87 mmol（/g·h），流经EMP途径的通量r4为82.13 mmol（/g·h），也即17.87%的底物分配到HMP途径，82.13%的底物分配到EMP途径。

根据HMP途径和EMP途径流量分配结果来看，在菌体表达外源蛋白β-甘露聚糖酶时，仍然有大量的底物被分解代谢产生能量供菌体合成β-甘露聚糖酶使用，同时，当β-甘露聚糖酶合成通量最大时，有17.87%的底物分配到HMP途径，与表3A中的HMP途径的通量相比，表3中HMP途径的通量增加了107.31%。说明当菌体进行外源蛋白β-甘露聚糖酶表达时，菌体对HMP途径产生还原力的需求更旺盛。

2.3 代谢节点分析

葡萄糖-6-磷酸连接着糖酵解途径和戊糖磷酸途径；丙酮酸连接着糖酵解途径、柠檬酸循环途径和部分氨基酸合成途径；这两个节点在生化网络中是关键性的节点，所以选择这两个节点进行分析。

2.3.1 葡糖糖-6-磷酸节点代谢流分析

两种不同极端代谢流在葡萄糖-6-磷酸节点的流向如图2所示，葡萄糖-6-磷酸一部分流向果糖-6-磷酸进入糖酵解途径，另一部分流向核糖-5-磷酸进入戊糖磷酸途径。

由图2可知，在两种极端代谢流分布情况下，葡萄糖-6-磷酸代谢流进入糖酵解途径（91.38/82.13mmol（/g·h））都占主导地位，剩余部分进入磷酸戊糖途径（8.62/17.87mmol（/g·h）），但两种情况下的代谢流分配仍有差异。进入糖酵解途径的代谢流在以菌体合成为主时较高，相反，进入戊糖磷酸途径的代谢流在以β-甘露聚糖酶合成为主时较高。结果表明，无论是合成菌体还是合成外源蛋白β-甘露聚糖酶，都需要大量的能量供给，并且在合成β-甘露聚糖酶时，菌体对戊糖磷酸途径的依赖性更高，同时也表明，葡萄糖-6-磷酸节点是一个受外界调控的节点。

图2 葡糖糖-6-磷酸节点代谢流分布Fig. 2 Metabolic flux distributions at glucose-6-phosphate node

2.3.2 丙酮酸节点代谢流分析

丙酮酸节点代谢流分布如图3所示，共有5部分构成，包括葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、乙酰辅酶A、氨基酸。

图3 丙酮酸节点代谢流分布Fig. 3 Metabolic flux distributions at pyruvate node

由图3可知，由于两种极端情况下，葡萄糖-6-磷酸节点流向糖酵解的通量不同（91.38/82.13 mmol（/g·h）），导致了两种极端情况下磷酸烯醇式丙酮酸流向丙酮酸通量的差异（74.25/55.87 mmol（/g·h）），也间接导致了丙酮酸流向乙酰辅酶A通量的差异（113.75/98.29 mmol（/g·h））。在两种极端条件下，丙酮酸流向草酰乙酸的通量是极度保守的（33.41/34.12 mmol（/g·h）），同时流向氨基酸的通量差异也很小（27.09/23.48 mmol（/g·h）），这些现象证实了丙酮酸节点是一个刚性节点，不受外界调控，与QUIRÓS M等[20]的研究结果一致。

3 结论

本研究成功构建了基因工程大肠杆菌（Escherichia coli）BL21合成β-甘露聚糖酶的代谢网络，建立了基于物料平衡的代谢流模型，并通过分批发酵验证模型是可靠的，应用该模型计算出最大菌体合成通量为9.39 h-1，最大β-甘露聚糖酶合成通量为0.18 mmol（/g·h）。菌体在合成β-甘露聚糖酶时，流向HMP途径的碳骨架增加了107.31%，HMP途径更为活跃。葡萄糖-6-磷酸节点是一个可调控的节点，而丙酮酸节点受外界环境调控较小，为理性改造产β-甘露聚糖酶大肠杆菌提供了理论基础，同时也为β-甘露聚糖酶的生产指明了调控方向。