止痛化癥胶囊的HPLC 指纹图谱研究

吴福林，董庆海，谭静，王涵，林红强，刘金平，李平亚

（吉林大学药学院，长春 130021）

止痛化徵胶囊由党参、炙黄芪、炒白术、丹参、当归、鸡血藤、三棱、莪术、芡实、山药、延胡索、鱼腥草、北败酱、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、泡姜、肉桂等共19 味中药组成，主治益气活血、散结止痛。用于气虚血瘀所致的月经不调、痛经、癓瘕，症见行经后错、经量少、有血块、行经小腹疼痛、腹有癓块，慢性盆腔炎见上述证候者。近年来，有关止痛化癥胶囊的研究主要集中在临床应用及有关化学成分的含量测定[1-4]，未见对其有关制剂质量控制标准、药效物质基础及入血成分等的研究报道。中药指纹图谱[5-8]是控制天然药物质量的有效方式之一，能全面整体地反映药品的质量，为中药的质量评价和控制提供参考。本研究首次利用高效液相色谱（HPLC）法对止痛化癥胶囊进行指纹图谱研究，建立了方法稳定、简便、可靠的止痛化癥胶囊高效液相色谱指纹图谱。结合指纹图谱对不同批次止痛化癥胶囊相似度进行评价，为止痛化癥胶囊的鉴别、质量控制提供新的科学依据，保证药品有效性及安全性，为制定全面的止痛化癥胶囊质量控制方法奠定一定工作基础。

1 材料

1.1 仪器

1525型HPLC、Waters 2998 二极管阵列检测器（American Waters 公司）；FA1104N 型万分之一电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司）；R201D 恒温水浴锅、旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；KQ3200V 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

乙腈、甲醇（色谱级，美国Fisher 试剂公司）；水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 药品及对照品

止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司提供，10 批药品批号依次为160303、161002、160905、161001、160502、160501、160503、160904、161003、160701。

丹参素（151106）、原儿茶酸（171109）、党参炔苷（17062207）、紫草酸（171220）、丹酚酸B（150927）（北京普天同创生物科技有限公司）；迷迭香酸（11871-2001102）、原儿茶醛（110810-200205）（中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：UniSil®5-120 C18 Ultra（4.6 mm×250 mm，5m）；流动相：乙腈-水（含0.05%的甲酸）；流速：1.0 mL/min ；进样量：20L；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm。流动相条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution table

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取药品胶囊内容物约3.0 g于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，超声处理（功率150 W、频率40 kHz）45 min，放冷，摇匀，过滤，蒸干，用甲醇定容至5 mL，过0.45m 滤膜，即得样品溶液。

2.2.2 混和对照品溶液制备 精密称取丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸、党参炔苷、紫草酸、丹酚酸B 对照品适量，加入甲醇溶解，摇匀，制备成含丹参素0.16 mg/mL、原儿茶酸0.20 mg/mL、原儿茶醛0.32 mg/mL、迷迭香酸0.25 mg/mL、党参炔苷0.11 mg/mL、紫草酸0.13 mg/mL、丹酚酸B 0.19 mg/mL的混合对照品溶液，4 ℃下冷藏，备用。

3 方法学考察

3.1 精密度试验

取同一批次止痛化癥胶囊（批号：160501），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6 号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间RSD 为0.09%～0.40%、相对峰面积RSD为0.76%～2.94%，表明方法精密度良好。

3.2 重现性试验

取同一批次止痛化癥胶囊（批号160501）5 份，按照“2.2”项下平行制备5 份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6 号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD 为0.08%～0.95%，相对峰面积RSD 为0.10%～2.87%，表明方法重复性良好。

3.3 稳定性试验

取同一批次止痛化癥胶囊（批号160501），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6 号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各主要色谱峰相对峰面积和相对保留时间。结果显示，各特征峰相对保留时间RSD 为0.09%～1.30%、相对峰面积RSD 为 0.89%～2.83%，表明方法在24 h 内稳定性良好。

3.4 止痛化癥胶囊HPLC 指纹图谱的相似度评价

将10 批止痛化癥胶囊分别按照“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件依次进样测定。按照国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）”分别对得到的色谱图进行指纹图谱分析，多点校正后进行自动匹配（时间窗为0.15），提取吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好的32个共有色谱峰，以6 号峰原儿茶醛峰为参照峰S，将参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。32 个共有色谱峰生成对照图谱R 与混合对照品溶液对照中，1 号峰为丹参素，2 号峰为原儿茶酸，6 号峰为原儿茶醛（S），23号峰为迷迭香酸，24 号峰为党参炔苷，25 号峰为紫草酸，28 号峰为丹酚酸B。将10 批止痛化癥胶囊样品所得指纹图谱分别导入相似度评价系统，计算得相似度分别为0.981、0.976、0.990、0.982、0.991、0.981、0.978、0.983、0.973、0.981。结果见表2、表3、图1、图2。

表2 共有指纹峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有指纹峰相对峰面积Tab.3 Relative peak area of common peaks

图1 混合对照品（S1）和对照指纹图谱（R）Fig.1 Mixed Control(S1)and Control Fingerprint(R)

图2 10批止痛化癥胶囊HPLC指纹图谱Fig.2 10 Batches of Zhitonghuazheng capsule HPLC fingerprint

4 讨论

4.1 供试品制备

本实验采用50%、70%和100%甲醇分别对3 g 止痛化癥胶囊内容物进行超声提取30 min，经考察，100%甲醇提取物基线平稳，响应值较高；以100%甲醇为提取溶剂，分别考察了超声提取30 min、45 min 及60 min 的供试品制备条件，观察其色谱峰的数目及其响应值，结果，45 min 和60 min 的色谱峰数目及响应值基本一致，表明45 min 超声提取供试品基本完全。

4.2 波长的选择

将供试品溶液进行190～400 nm紫外-可见光全波长扫描发现，在230 nm 和280 nm 处下各色谱峰的数目及丰度较好。经考察，230 nm的色谱峰基线不平稳、峰形差，280 nm的色谱峰基线平稳、分离度较好，适合指纹图谱研究，故本研究选择280 nm 为检测波长。

4.3 流动相及流速的选择

本实验考查了甲醇-水、甲醇 0.05%甲酸水、乙腈-水、乙腈 0.25%醋酸水、乙腈 0.05%甲酸水等流动相系统，乙腈 0.05%甲酸水作为流动相梯度洗脱能够使色谱峰分离度较好、基线平稳，所以选用乙腈 0.05%甲酸水流动相系统进行指纹图谱的研究。在其他色谱条件一致的情况下，对流速条件进行了考察，分别设定流动相流速为0.5 mL/min、0.8 mL/min 及1 mL/min，经考察，流速为1 mL/min 的色谱图整体分离效果较好，适合指纹图谱研究。

4.4 进样量的考察

4.5 柱温的考察

在其他色谱条件一致的情况下，对其柱温进行考察，分别设定柱温30 ℃、35 ℃及40 ℃，并对其色谱图进行分析，结果表明，柱温30 ℃的色谱峰基线平稳、分离度较好、响应值较好，适合指纹图谱研究。

5 止痛化癥胶囊HPLC指纹图谱的首次建立

《中国药典》2015 版一部规定，止痛化癥胶囊的质量利用薄层色谱法进行鉴别，采用高效液相色谱法（通则0512）测定丹参素的含量控制，本品每粒（0.3 g）含丹参以丹参素（C9H10O5）计，不得少于0.20 mg[9]。但这种单一成分的质量控制不足以体现药品质量的优劣，中药复方指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一。查阅文献，尚未发现止痛化癥胶囊指纹图谱的研究报道，因此，本试验借助HPLC技术弥补了止痛化癥胶囊指纹图谱的空白，首次建立了不同批次止痛化癥胶囊的HPLC 特征指纹图谱，且方法稳定、简便、可靠。10 批止痛化癥胶囊样品图谱与生成的对照图谱相匹配，相似度结果为0.981、0.976、0.990、0.982、0.991、0.981、0.978、0.983、0.973、0.981，均大于0.95 以上。可见，不同批次间止痛化癥胶囊的化学成分无较大差异、相似度较高、一致性良好，反映出止痛化癥胶囊的质量平稳。

6 结论

本试验所建立的止痛化癥胶囊HPLC 指纹图谱,分析方法简单、准确、重复性好，共标定了32 个共有色谱峰；通过与对照品比对，指认出其中7 种成分，分别为丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸、党参炔苷、紫草酸、丹酚酸B。本研究可为止痛化癥胶囊的鉴别、质量控制提供一定的科学依据，指纹图谱结合相似度分析可有效综合评价不同批次止痛化癥胶囊的质量，进而对全面制定止痛化癥胶囊的药品质量标准具有重要意义。