8种染色方法对组织切片中虾肝肠胞虫染色效果的比较

常晓晴，王 元，英 娜，李楠英，黄 倞，李新苍，周俊芳，房文红

(1．中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090； 2．上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，简称EHP)是一种主要侵染对虾肝胰腺细胞并在其内形成孢囊结构的微孢子虫。最初，2001年CHAYABURAKUL等[1]在研究泰国斑节对虾(Penaeusmonodon)生长缓慢疾病时首次检测到EHP，但未对其进行描述和命名，随后，TOURTIP等[2]对其组织病理、超微结构以及系统进化等方面进了研究，并正式命名。近几年，国内外许多地区如泰国[3]、越南[4]、印度[5]、中国[6-7]、马来西亚[8]以及印度尼西亚[9]等均发现和报道了该寄生虫的暴发流行。EHP的宿主除斑节对虾外，已确认的还有蓝对虾(Penaeusstylirostris)以及凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)。多数研究者认为EHP与凡纳滨对虾生长迟缓有关[10-11]，且对全球凡纳滨对虾产业健康发展已造成严重威胁。

病理诊断是目前临床医学中最可靠的一种定性诊断，具有其它检查无法替代的权威性，被誉为疾病诊断的“金标准”[12]，而组织石蜡切片是病理诊断中最常用的一种手段。组织染色是利用各种特定染料与组织细胞中不同成分结合反应而使其呈现出不同颜色，是组织切片制作中一个至关重要的环节，染色质量的好坏将直接影响最终的观察效果，是检出病原以及准确反映病理变化的关键。由于虾肝肠胞虫是近年来新发现的一种对虾病原，有关该寄生虫病的特殊染色方法的研究较少，本研究比较了苏木精-伊红(HE)染色法、Masson染色法、爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺蓝(TB)染色法、伟郝夫范吉森(EVG)染色法、劳克坚牢蓝(LFB)染色法、天狼猩红(Sirius red)染色法和普鲁士蓝(PB)染色法对凡纳滨对虾肝胰腺中虾肝肠胞虫的染色效果，以便筛选出稳定、准确、清晰的染色方法，为虾肝肠胞虫病的诊断及其病理研究提供更有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

样品为2016年上海郊区养殖场采集的疑似患病凡纳滨对虾活体，取其肝胰腺组织投入Davidson’s AFA固定液中，固定24 h后换液一次。固定的组织块经梯度乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋后进行连续切片，厚度约5 μm。切片经二甲苯脱蜡再经梯度乙醇脱水后，采用不同染色方法染色，最后常规脱水、透明、封片。

1.2 染色方法

1.2.1 苏木精-伊红(HE)染色法

参考BELL[13]的方法，稍作改进：切片入Harris苏木素染5 min，流水冲洗5 min；含1%盐酸酒精(99份无水乙醇+1份浓盐酸)分化数秒，流水冲洗；0.6%氨水返蓝，流水冲洗。然后，切片入伊红染液中染色3 min。

1.2.2 Masson染色法

参考GOLDNER[14]的方法，稍作改进：切片用Weigert氏铁苏木素液染5 min，流水冲洗；含1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗数分钟返蓝，丽春红酸性品红液染8 min，蒸馏水快速漂洗；磷钼酸水溶液处理约4 min，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸分化1 min。

1.2.3 爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法

参考黄云梅等[15]的方法，稍作改进：切片入阿利新蓝染液浸染10 min，稍水洗，0.5%高碘酸水溶液氧化10 min，流水冲洗数分钟后再用蒸馏水漂洗两次，再用雪夫试剂暗处浸染20 min，流水冲洗10 min。

1.2.4 甲苯胺蓝(TB)染色法

参考吴敏等[16]的方法，切片用甲苯胺蓝染液染色10 min，95%乙醇分化1 min，风干后封片。

1.2.5 伟郝夫范吉森(EVG)染色法

参考胡晓磊等[17]的方法，Verhoeff’s染液染20 min，至颜色呈深黑色，流水冲洗，2%三氯化铁溶液分化10～20 s，流水冲洗，5%硫代硫酸钠溶液处理1 min清除多余碘，流水冲洗后再蒸馏水漂洗2次；Van Gieson’s液复染5 min，无水乙醇漂洗1 min。

1.2.6 劳克坚牢蓝(LFB)染色法

参考张丽等[18]的方法，稍作改进，切片置于0.1% LFB染液60 ℃ 孵育过夜，流水冲洗；浸入70%乙醇中30 min；浸入0.05% 碳酸锂中分色约1 min，流水冲洗；0.1%伊红复染1 min，流水冲洗5 min。

1.2.7 普鲁士蓝(PB)染色

参考董鸿瑞等[19]的方法，切片入2%亚铁氢化钾和2%盐酸混合染液(1∶1)中染色20 min；流水冲洗2 min，蒸馏水洗，0.1%核固红染液复染10 min，蒸馏水洗5 min。

1.2.8 天狼猩红染色

参考沈蔷等[20]的方法，稍作改进，切片入饱和苦味酸天狼猩红染色液内染色8 min，无水乙醇漂洗约1 min，风干后封片。

1.3 显微观察及数据分析

制备的切片用Olympus BX51多功能显微镜在1 000倍下观察，Image-Pro Plus 5.1软件拍照，图像采集分析。

EHP的检出率是将每种染色方法染色后的切片均在显微镜400倍下观察，观察记录每个视野下所有肝小管，和被感染肝小管的数量。定义：检出率=单个视野镜检EHP感染肝小管数量/单个视野镜检的肝小管数量，视野内含肝小管结构的一半及以上视为一个肝小管。采用两种方法计算检出率：方法一：同位置法，8张连续切片分别用8种染色方法染色后在400倍镜下，观察4个相同位置，进行统计，计算检出率；方法二： 随机法，8种染色方法对应的连续切片上，随机取4个视野，统计检出率。因HE染色为常规染色方法，本次统计学分析使用HE染色检出率的平均值为检验值，其它染色组样本与HE染色样本进行单样本t检验，使用SPSS 19.0软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 HE染色效果

凡纳滨对虾肝胰腺组织中肝小管的基膜呈粉红色，管壁细胞层中各类细胞核呈现蓝紫色，细胞核核膜及核仁边缘光滑，边界清晰，胞浆呈现深浅不同的粉红色，细胞整体的形态结构染色清晰。虾肝肠胞虫孢囊整体形状轮廓较清晰，其内大量孢子在宿主细胞中呈现出颗粒感，孢子被染成粉红色，与细胞浆背景颜色相比，染色稍深，但不易区分，单个孢子形状不清晰，似卵圆形(图版I-1)。

2.2 Masson染色效果

宿主肝小管的基膜呈蓝靛色，细胞核着色深，尤其是核仁呈深红色，核膜与胞浆边界清晰，细胞浆呈现深浅不同的蓝灰色。虾肝肠胞虫孢囊整体形状轮廓清晰，其内大量孢子在宿主细胞中呈现出强烈的颗粒感，孢子被染成妃红色或品红色，与宿主细胞核相比染色稍浅，但与细胞浆颜色差异明显，背景清晰，易辨别，且单个孢子的形状较清晰，为椭圆形，更接近湿涂片中新鲜孢子的形状(图版I-2)。

2.3 AB-PAS染色效果

宿主肝小管基膜呈现绛紫色，各细胞边界模糊，不易区分，且细胞核与细胞浆均呈现淡酱紫色，细胞形态结构不清晰。虾肝肠胞虫孢囊整体形状轮廓不清晰，其内大量的孢子虽表现出颗粒感，但孢子形态模糊，雪夫试剂将孢子染成淡红色，与背景颜色对比差异不明显，不易辨别(图版I-3)。

2.4 TB染色效果

宿主肝小管基膜、细胞浆均呈浅蓝色，细胞核形态不清晰，核仁染色深，核膜与细胞浆边界模糊。强嗜碱性细胞整个被染成深蓝色。虾肝肠胞虫孢囊整体形状轮廓清晰，其内大量孢子呈现较强的颗粒感，多数孢子被染成紫红色或深蓝色，形状较清晰，与背景颜色对比差异较明显，少数孢子染色后与背景颜色差异不明显，不易分辨(图版I-4)。

2.5 EVG染色效果

宿主肝小管基膜和细胞浆均呈现灰黄色，各细胞细胞核边界清晰，核仁呈现黄黑色。强嗜碱性细胞整个呈现深黑灰色。虾肝肠胞虫孢囊整体形状轮廓较清晰，孢子呈现蓝灰色，与背景颜色对比差异不明显，形态模糊，颗粒感差，不易辨别(图版I-5)。

2.6 LFB染色效果

宿主肝小管基膜、各细胞的细胞浆和细胞核均呈青蓝色，颜色一致，细胞形态结构不能辨别。虾肝肠孢虫包囊轮廓无法辨识，部分孢子呈蓝色，部分孢子呈不透明的黑色，与背景颜色相比差异极明显，分散在细胞浆中孢子表现出强烈的颗粒感，但整个切片中，孢子数量相对较少(图版I-6)。

2.7 PB染色效果

宿主肝小管基膜、各细胞的细胞浆均呈淡粉红色，各细胞形态模糊，但细胞核形状清晰，核仁呈粉红色。虾肝肠胞虫孢囊轮廓模糊，孢子形态模糊，无颗粒感，与背景颜色无差异，难辨别(图版I-7)。

2.8 天狼猩红染色效果

宿主肝小管基膜呈淡红色，各细胞均呈黄色，且形态结构模糊。虾肝肠胞虫孢囊轮廓模糊，孢子形态模糊，难辨别(图版I-8)。

2.9 检出率

2.9.1 同位置视野检出率结果

2.9.2 随机视野检出率结果

对随机位置法检出率进行t检验的结果如表2所示。

上述两种不同统计方法得出的EHP孢子检出率，均以Masson染色最高，LFB染色次之。

3 讨论

特殊染色法是病理学研究常用的方法之一，也是临床病理诊断中重要的辅助技术之一。特殊染色技术具有特异、简单、快捷、廉价等显著优点，并且这些技术也在发展和完善，至今还没有出现更好的能完全替代它的直接显示细胞内外特殊化学物质的简便易行的方法和技术。但其在组织病理分析时耗时较长，对实验人员的专业经验要求较高，并且在水产生物轻微感染微孢子虫时易诊断失败。微孢子虫病的石蜡切片染色是其病原检测的基础，但是不同的染色技术在其形态学观察中的作用却不甚明确，因此本实验对比了8种染色技术对虾肝肠胞虫的染色效果。

表1 8种染色方法对虾肝肠胞虫孢子检出率结果的统计学分析(同位置视野)Tab.1 Statistical analysis of the detection rate of 8 staining methods for EHP (the same scan filed)

注：*表示P<0.05

Note：*meansP<0.05

表2 8种染色方法对虾肝肠胞虫孢子检出率结果的统计学分析(随机视野)Tab.2 Statistical analysis of the detection rate of 8 staining methods for EHP (random scan filed)

注：*表示P<0.05

Note：*meansP<0.05

对虾肝肠胞虫是近年来的新发现病原之一，有关该寄生虫病的特殊染色方法的研究较少，目前国内外多数研究者采用常规的苏木素-伊红(HE)染色法。HE染色技术是病理技术中最经典的染色方法，是由WALDEYER于1863年首先提出来的，一直沿用至今。RAJENDRAN等[5]利用 HE染色法分别对凡纳滨对虾肝胰腺组织中的孢子和纯化后的孢子进行了染色，结果表明，纯化后的孢子染色效果明显优于组织中的孢子染色效果，这说明肝胰腺组织对HE染色法检测EHP产生干扰。SALACHAN等[3]对比了HE染色和原位杂交技术对肝胰腺组织中EHP的检测效果，发现在低倍镜下，HE染色切片中EHP不能被识别出，而原位杂交切片中EHP则易被检出，故认为后者比HE染色更可靠，但此法耗时长、成本高。本研究也发现，虽然HE染色对肝胰腺组织细胞的染色效果不错，但对孢子着色较浅，与背景颜色接近，在低倍镜下孢子的辨识度低，特别是在孢子数量较少、孢囊较小的时候，更不易与肝胰腺组织区分，不仔细观察而易造成漏检，影响诊断结果的准确性，综合分析效果并非最优。

Masson染色方法的原理是利用铁苏木素着色细胞核，利用酸性品红和苯胺蓝着色胞浆，从而使组织不同成分显示不同颜色。该法在诊断慢性炎症、纤维性肿瘤以及肝、肾、心脏等机体纤维化病变中具有重要应用[21]。通常情况下，组织多采用甲醛固定，经Masson染色后胞浆为红色，细胞核为蓝色(苯胺蓝复染)或绿色(亮绿复染)。而本研究中，对虾肝胰腺组织为Davidson’s AFA液固定，经染色后，胞浆呈蓝灰色，细胞核核仁呈深红色，这种明显的差异很可能与固定试剂的不同有关。黄利等[22]研究了不同固定液对Masson染色结果的影响，发现Bouin氏液固定的组织细胞核、胞浆染成紫红色，而10%甲醛固定的组织细胞核染成绿色，胞质染成紫红色。这表明不同固定液对 Masson 染色结果影响较大。本文中，宿主细胞核、胞浆、基膜均呈不同颜色，结构清晰易辨别，说明对宿主的组织细胞染色效果Masson染色法与HE染色法两者差别不明显；而经Masson染色后的孢子呈鲜艳红色，与背景对比鲜明，虽然孢子颜色和与宿主细胞核核仁颜色接近，但前者形态呈小颗粒椭圆形，且数量多，似石榴籽，后者呈圆形，单个体积大，周围空白，外围有核膜包围，二者形态结构差异大，容易区分。Masson染色结果显示组织结构清晰，对比鲜明，颗粒清晰可见，此方法既能检出肝胰腺组织中的大量孢子，又能将宿主的各细胞形态结构清晰显示，弥补了HE染色的不足，说明Masson染色法对虾肝肠胞虫的染色效果优于HE染色法。本文系首次将Masson染色应用于微孢子虫病研究。

AB-PAS染色是综合利用阿利新蓝染色和常规PAS染色两者的优点，可检测组织中的糖原、中性粘多糖、酸性粘多糖以及真菌[23]等物质成分。组织中的糖类成分与染色剂中的过碘酸发生作用，产生出游离的醛基再与无色碱性品红反应而显示出紫红色；而组织中的酸性粘液物质与水溶性的碱性染料AB反应而显示为蓝色，从而使红色的PAS反应物和蓝色的AB反应物同时呈现在一张切片中。肝胰腺是对虾机体代谢重要器官，是糖原储存的主要场所之一，因而PAS染色反应可将其内糖原物质染成红色，而EHP属于真菌类生物，其孢子的孢壁中含有与真菌细胞壁类似的多糖类物质，经染色也同样呈现紫红色，因而背景与病原颜色差异小，不利于观察。

甲苯胺蓝是一种具有异染性的碱性染料，含有发色团和助色团，一般组织细胞中的细胞核等酸性成分被染成为与染料本色相同的蓝色，而特殊的细胞，如肥大细胞，该细胞浆内充满许多粗大的嗜碱性颗粒，这种颗粒因含有肝素、组胺等具异染性的成分而被染成与染料本色相异的紫红色[16]。本文中虾肝肠胞虫的部分孢子也被染成紫红色，这说明孢子中也含有异染性的成分，在400倍镜下紫红色的孢子与背景蓝色对比并不明显。而TOURTIP等[2]发现EHP孢子经甲苯胺蓝染色后颜色为均一的深蓝色，此现象与本文结果不一致，这可能与固定液不同有关，后者使用的是戊二醛固定液，可能戊二醛与孢子发生作用，致使孢子中的异染性物质发生改变。

EVG染色法也是一种用于显示弹力纤维和胶原纤维的病理诊断方法，经EVG染色后，弹力纤维和细胞核呈黑色，胶原纤维呈红色，从而区分及判断这两类纤维的病变情况[24]。本实验中，该染色方法虽然能显示细胞的基本结构，但对EHP孢子染色效果不好，容易造成漏检。

LFB染色是一种常用的显示髓鞘的染色方法[25]，本实验中，肝胰腺组织被染成淡蓝色，而EHP孢子变成黑色，这可能是其与劳克坚牢蓝结合不紧密造成的，在乙醇和碳酸锂分化过程中，孢子褪至无色，以致其与背景色差界限明显。虽然散落的孢子在光镜下极易识别出，但是，EHP孢囊结构在染色过程中被破坏，孢子似部分丢失，形态也不均一，而且背景中无法区分组织细胞结构。

天狼腥红作为一种强酸性染料，普遍应用于人或动物肝、肾等脏器纤维化病变的染色[26]，通常需要与偏光镜结合使用才能发挥出其作用，本文分别于普通光学显微镜下和偏振光显微镜下观察，发现EHP孢子在两者视野中均与背景无区别。

普鲁士蓝染色多用于检测人类肝、肾脏的铁血黄素沉积，铁血黄素颗粒与染液发生反应而呈现蓝色，而其它的细胞成分则被染成浅红色[19,27]，本文中对虾肝胰腺组织及EHP均被染成淡粉红色，未发现蓝色成分。

与前述6种染色方法相比，普鲁士蓝和天狼腥红染色后，在脱色过程中，肝胰腺组织与孢子同步脱色，最终两者颜色反差不大，孢子的形态不再可辨。

通过镜检发现，孢子与背景颜色差异效果在低倍镜下(40×物镜)比高倍镜(100×物镜，图版I)下差，而400倍又是常用的研究组织病理的放大倍数，并且单个视野下大约包含15个肝小管，适于数据采集。因此我们选择400倍作为检出率的评价标准，在此放大倍数下如果孢子与背景颜色对比明显，易于识别，则孢子的检出率高，不同染色方法使孢子在400倍镜下的可见性也侧面印证了该染色方法的优劣，可进一步证实染色方法的可靠性。通过连续切片发现，宿主细胞内的孢子形成的团块形状变化较大，大小一般约为5～10 μm, 而切片厚度为5 μm, 一个孢子团在经历1～2次连续切片后往往在第二或第三个连续切片上消失了，导致同一个肝小管在连续切片上孢子的检出率并不相同，为避免这种情况造成的统计误差，我们选择随机方法对检出率再次统计。

统计学结果中P<0.05时表示该染色方法与HE染色法具有明显差异，除了AB-PAS染色法之外的其它6种染色方法都与HE染色法有显著性差异。其它染色法与HE染色法进行单样本t检验的t值为正值时表示孢子染色检出率高于常规HE染色法，当t值为负值时则相反。结果表明，Masson染色的孢子检出率最高，在虾肝肠胞虫组织切片检测中具有明显优势；LFB在检出率上虽优于HE染色，但该染色方法可能存在破坏孢囊结构的现象，因此不适用于病理变化分析；其它4种染色方法的EHP检出率均低于HE染色法，其中PB染色和天狼腥红染色的t值为绝对值最大的负值，表示两者在虾肝肠胞虫染色上效果最差。

综上所述，所列8种染色方法对虾肝肠胞虫的染色各有优缺点，其中Masson染色法效果最优，因此，Masson染色可用于微孢子虫临床病理诊断和病理组织学研究。

图版I 不同染色方法下的肝胰腺组织及虾肝肠胞虫孢子
Fig 1 Hepatopancreas tissue and spores of EHP under different staining methods
注：1，HE染色；2，Masson染色；3，AB-PAS 染色；4，TB染色；5，EVG染色；6，LFB染色；7，PB染色；8，天狼腥红染色。B：基膜，N：细胞核，S：孢子。所有标尺=10 μm。
Note：1, HE staining; 2, Masson staining; 3, AB-PAS staining; 4, TB staining; 5, EVG staining; 6, LFB staining; 7, PB staining; 8, Sirius red staining; B: Basilar membrane; N: Nucleus; S: Spores. All scale bars =10 μm.