牛栏山白酒酿造过程中扣囊复膜酵母的分离与产物分析

郝文军，刘红霞，于晓涛，李艳敏，孙海波，朱婷婷，王英杰，魏金旺

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101300）

扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），也称拟内孢霉，是清香型白酒酒曲的主要上霉微生物，也是酒醅发酵阶段重要的功能性微生物[1]。刘志磊等[2]通过对清香型大曲和酒醅中的酵母类微生物鉴定后发现1株肋状拟内孢霉，与模式菌株Saccharomycopsis fibuligera s5b-2相似度达99.31%。胡建华等[3]从牛栏山清香型白酒大曲及酒醅中分离得到3株拟内孢霉，并成功应用到醇甜基酒生产中，但对拟内孢霉产生的醇甜成分没有进行深入分析；陈蕾等[4]研究发现，陆地扣囊复膜酵母具有高活力的淀粉酶，能水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键；张志才[5]将扣囊复膜酵母制成麸曲，使前期发酵醪温度上升1℃，出酒率提高。目前，对扣囊复膜酵母的研究多集中在菌种鉴定和相应酶活的研究上，对其代谢产物的研究还鲜有报道。本试验旨在对牛栏山清香型大曲和酒醅进行常规微生物分离，从而获得扣囊复膜酵母菌株，并分析其代谢产物及与牛栏山二锅头白酒的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清香酒醅：取自牛栏山酒厂酿酒车间。

主要试剂：酵母浸粉、蛋白胨、琼脂，北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-430型生化培养箱，宁波江南仪器厂；TD-2002B型电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司；YXQ-LS-75Ⅱ型压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；7890B-5977B气质联用仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 培养基的制备

YPD培养基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、琼脂20 g、水1000 mL，115 ℃，灭菌30 min，倒平板备用。

高粱培养基：高粱，4瓣、6瓣、8瓣粉碎，70%沸水润粮24 h，分装入500 mL三角瓶中，每瓶100 g，121℃灭菌蒸粮30 min，趁热摇散，降温备用。

1.4 扣囊复膜酵母的分离与纯化

称取5 g清香酒醅，放入装有45 mL无菌水的三角瓶中，摇床振荡20 min形成混悬液；移液器吸取1 mL混悬液加入到装有9 mL无菌水的试管中，摇匀为10-2浓度；依次从试管中吸取1 mL混悬液，加入到9 mL无菌水的试管中，配制成10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度。分别取10-4、10-5、10-6混悬液在YPD平板上进行微生物涂布分离，置于28℃下培养72 h，观察菌落形态并从中挑取形态不同的扣囊复膜酵母进行平板纯化，直到得到相应的纯菌落为止。

1.5 扣囊复膜酵母的培养

挑取1环不同的纯菌落，分别置于装有2 mL无菌水的小试管中，搅匀得到菌悬液，将该菌悬液倒入装有高粱培养基的三角瓶中，摇拌均匀，置于28℃培养箱中培养，中途摇瓶数次。对照样为不接种的纯高粱培养基。

1.6 扣囊复膜酵母香气跟踪

通过鼻子闻香的方式对培养第7天和第13天的扣囊复膜酵母的香气变化情况进行跟踪。

1.7 扣囊复膜酵母在高粱培养基中生长后代谢产物的测定

准确称取1 g高粱培养基于20 mL顶空瓶中，加入8 mL纯净水，然后加入3 g NaCl，内标（丙酸辛酯和薄荷醇混标的浓度分别为60.55 ppb和125.2 ppb）10 μL。顶空固相微萃取进样，具体条件如下。

进样方式顶空自动进样；进样口：无分流进样。

萃取头：三项纤维萃取头。顶空温度：50℃；浸提时间：40 min。

色谱柱：DB-FFAP122-3262，最高温度250℃，60.0 m×0.25 mm×0.25 μm。载气流量2 mL/min。

升温程序：50℃（2 min）→4℃/min→230℃（15 min）。

离子源电压：70 eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；辅助加热区温度：280℃。

质量扫描范围：35.0～350.0。

2 结果与分析

2.1 扣囊复膜酵母的菌落形态（图1）

图1 不同扣囊复膜酵母的菌落形态

用接种针挑取少量菌体接种在相同的YPD平板上培养48 h，形成单菌落，见图1，菌落顺序从左向右依次编号为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。从图1可以看出，SF1—SF5菌落形态存在明显差异。SF1为乳白色菌落，形态呈不规则状，向上突起形成巨大褶皱，长满微小绒毛，不易挑取；SF2为暗白色菌落，形态呈向上突起的圆形，长满微小绒毛并向四周辐射生长，不易挑取；SF3为雪白色菌落，形态呈不规则圆形，向上隆起，中间扁平，长满细小绒毛，并向外辐射生长，不易挑取；SF4为雪白色菌落，形态呈不规则圆形，微向上隆起并伴有多条长线状突起，中间扁平，长满微小绒毛，不易挑取；SF5为乳白色菌落，形态不规则，向上隆起，长满致密的绒毛，不易挑取。

2.2 培养时间及方式的选择

通过早期实验对不同发酵时间的牛栏山清香型酒醅进行跟踪得知，扣囊复膜酵母在入池的前3天开始大量繁殖，而后数量出现小幅度的下降和再上升的态势，发酵7 d后，扣囊复膜酵母数量开始大幅度下降，直到第13天基本全部死亡，这与酒醅中氧含量有直接关系。根据这一规律，将这5株菌的培养条件进行适当调整，前7天使用透气的封口膜密封三角瓶，可见高粱表面长满白色的扣囊复膜酵母菌体；7 d后改为保鲜膜密封培养，使三角瓶内氧气逐渐被消耗完，第13天结束培养。

2.3 扣囊复膜酵母在高粱培养基中的香气分析（表1）

表1 不同扣囊复膜酵母在高粱培养基中的香气变化

根据2.2中所述的扣囊复膜酵母在酒醅的变化规律，将第7天、第13天定为两个关键点，通过用鼻闻,判断这5株菌的香气变化情况，初步确定培养基中是否有呈香化合物生成。从表1可以看出，SF1的香气在第7天时呈现较强的水果香气，第13天伴随出现令人不愉快的臭味；SF2、SF4在第7天时散发出不愉快的臭味，但第13天时伴随出现较弱的果香；SF3在第7天时水果香较强烈，第13天时果香减弱，出现淡淡的不愉快的臭味；而SF5在第7天时水果香较淡，第13天时果香消失，出现令人不愉快的臭味。综合分析，5株扣囊复膜酵母在培养7 d和13 d时，均出现明显的香气变化，这说明培养基中确实有呈香化合物生成。

2.4 扣囊复膜酵母在高粱培养基中的代谢产物分析（表2）

为了确定扣囊复膜酵母代谢生成的化合物类型，实验利用气质联用仪对培养13 d的扣囊复膜酵母培养基进行微量成分的半定量分析。从表2可以看出，扣囊复膜酵母在高粱培养基中生长繁殖时，确实可以代谢生成多种化合物，其中包括9种酯类化合物、5种内酯类化合物、7种醇类化合物、9种萘酚类化合物、7种酸类化合物、4种醛酮类化合物，这些化合物中多数都呈现出特殊香气。

王勇等[7]等利用GC-O和GC-MS技术分析牛栏山二锅头白酒，一次性检测出92种香气化合物，其中有25种香气成分对白酒整体香气贡献最大。通过成分对比发现，上述5株扣囊复膜酵母的代谢产物中，有6种化合物是牛栏山二锅头白酒中重要的香气成分，分别是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈创木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸[7]。苯乙酸乙酯具有浓烈而甜的蜂蜜香气；乙酸苯乙酯带有粉香的蜂蜜样香气，类似苹果样的果香；苯乙醛具有浓郁的玉簪花香气，稀释后有类似水果的甜香气；4-乙基愈创木酚带有香瓜香；苯乙酸在低浓度时具有甜蜂蜜味；3-甲基丁酸有刺激性酸败的臭味，高度稀释后则有甜润的果香。表2中数值显示，5株扣囊复膜酵母在第13天的检测中，培养基中的3-甲基丁酸积累量最大，推测是造成扣囊复膜酵母在闻香时伴有令人不愉快臭味的重要因素之一。

扣囊复膜酵母作为牛栏山清香型酒醅中的主要优势微生物，其代谢产生的多种呈香化合物与牛栏山二锅头白酒的重要香气化合物重合，由此可以推断，扣囊复膜酵母在牛栏山二锅头白酒的酿造过程中起着很重要的作用。

表2 13 d时扣囊复膜酵母代谢产物半定量分析

3 结论

通过对牛栏山清香型酒醅分离，得到5株菌落形态不同的扣囊复膜酵母，编号为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。对这5株菌进行纯培养后发现，在第7天和第13天时，这5株菌在香气方面发生明显改变；通过对培养基中代谢产物半定量分析发现，扣囊复膜酵母可以代谢生成多种化合物，其中有6种化合物是牛栏山二锅头白酒中重要的香气成分，分别是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈创木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸，可以推测，扣囊复膜酵母在牛栏山二锅头白酒的酿造过程中起着很重要的作用。