杨湖强化酱香麦曲的制备工艺研究

霍颖玙 ，赵 娟 ，李宪德 ，王海净 ，王晓丹 ，胡鹏刚 ，邱树毅

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025； 2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025； 3.山东杨湖酒业有限公司，山东菏泽274000）

白酒是中国传统蒸馏酒，根据生产工艺的不同，白酒分为不同香型，酱香型白酒以茅台为代表，具有“酱香突出，优雅细腻，酒体醇厚，香味协调，回味悠长，空杯留香持久”的特点[1]，深得广大消费者的喜爱。酱香酒的核心产区在贵州省茅台镇，其炎热、湿润的气候特点，使得微生物易于生长，十分有利于酿造酱香白酒微生物的栖息、生长和繁殖。我国北方地区也生产酱香型白酒，但由于干燥、寒冷等气候特点，不适于酿造酱香白酒微生物的栖息、繁殖和生长，因此所产酱香型白酒质量和产量均不如茅台镇核心产区，酿造的白酒酱香风味较差。通过制作出酱香型强化麦曲，以弥补气候与地域环境给酿造酱香白酒带来的缺陷。增加酱香型白酒的产量和丰富酱香型白酒的风味，对提高北方酱香型白酒酿造品质的意义重大。

近年来，许多学者对白酒的酱香风味展开研究。张荣等[2]从高温大曲中分离得到了3株产酱香的菌，经鉴定为地衣芽孢杆菌，发现其发酵液在6 d后呈现明显的酱香，并在发酵液中检测到了乙偶姻、四甲基吡嗪以及呋喃扭尔。ZHU B F等[3]从高温大曲中分离得到枯草芽孢杆菌，研究表明，枯草芽孢杆菌利用乙偶姻产四甲基吡嗪，而且该菌发酵液中四甲基吡嗪含量可达到4.08 g/L。徐岩等[4]对中国白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制进行了研究，研究验证了中国白酒中四甲基吡嗪产生的主要途径来源于微生物的代谢反应，而不是美拉德反应。本课题组[5]也从高温大曲中筛选出两株地衣芽孢杆菌，将这两株菌株模拟白酒生产固态发酵，对其发酵产物进行GC-MS分析表明，该两株菌的风味物质成分中吡嗪类物质含量均较高，并且以四甲基吡嗪为主。本研究将筛选出的高产吡嗪类的地衣芽孢杆菌添加到制曲小麦粉中制成麦曲，以提高麦曲中吡嗪类物质的含量，从而达到丰富麦曲酱香风味的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

FBKL 1.0199与FBKL 1.0201，本课题组从贵州茅台镇酱香型白酒生产用曲中分离筛选得到，经鉴定为地衣芽孢杆菌。

1.1.2 试剂

制曲小麦粉来源于山东杨湖酒业有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏4 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖5 g、蒸馏水1000 mL，pH7.0～7.2，0.1 MPa压力灭菌30 min。

浅盘培养基：麸皮1500 g，加水60%（接入液体三角瓶后含水100%），拌匀，0.1 MPa压力杀菌60 min。

帘子种曲培养基：麸皮15 kg，加水90%，拌匀堆积润料30 min，0.1 MPa灭菌60 min，取出降温至45℃。

通风曲培养基：小麦300 kg，泼入约400 kg的水，0.1 MPa压力蒸料40 min，降温至50℃。

1.2 仪器与设备

Stable Flex纤维头（DVB/CAR/PDMS），美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪，安捷伦科技有限公司；FA1004电子天平，上海箐海仪器有限公司；TDL-5低速离心机，南京东迈科技仪器有限公司；KQ-300DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌液的制备

从活化的牛肉膏蛋白胨培养基平板上挑取地衣芽孢杆菌菌落至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃、150 r/min条件下培养24 h。

1.3.2 细菌菌落总数的测定

采用稀释涂布平板法计数，37℃倒置培养24 h，记录菌落总数。

1.3.3 麦曲理化指标的测定

参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》中的测定方法对大曲水分、淀粉、酸度、液化力、糖化力、酯化力、发酵力进行测定。

1.3.4 GC-MS分析实验

采用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术结合GC-MS分析麦曲中挥发性成分及吡嗪类物质的含量[6-11]。

样品处理：取麦曲15 g，研磨充分后加入30 mL蒸馏水浸泡10 min，然后超声波处理30 min，取出离心或过滤，吸取上清液5 mL于15 mL萃取瓶中，加入 1.5 g NaCl。插入装有 2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纤维头的手动进样器，在60℃左右顶空萃取40 min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3 min进样。采用全扫描模式对样品中挥发性成分进行检测。

气相色谱条件：色谱柱CP-WAX（30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温35℃（保持5min），以4℃/min升温至135℃，再以8℃/min升温至180℃保持5 min，运行时间43 min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦（He）（99.999%）；柱前压7.62 psi，载气流速0.8 mL/min；分流进样，分流比为20∶1；溶剂延迟时间2 min。质谱条件：电子电离源（electron ionization，EI），离子源温度230 ℃，接口温度250℃。

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检测及核对Nist2005和Wiley标准质谱图，确定了挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。

2 结果与分析

2.1 强化细菌的特性

FBKL1.0199、FBKL1.0201菌株经鉴定为地衣芽孢杆菌，其模拟白酒固态发酵的挥发性成分分析结果见图1。

由图1可知，这两株菌在模拟白酒固态发酵时，其挥发性成分种类较多，包括醇、醛、酮、酯、酚、吡嗪等，对酱香型白酒风味贡献较大的吡嗪类物质含量分别达到46.01%和48.32%。经课题组应用于酱香型白酒生产实践中，可以明显提升酱香型白酒基酒的酱香风味。

图1 FBKL1.0199、FBKL1.0201模拟固态发酵产物挥发性成分百分含量图

2.2 强化酱香麦曲的制备

强化酱香纯种麦曲的制备工艺如下：

液体三角瓶培养：在无菌条件下，将菌种用接种针各接1环于三角瓶中，每个菌种接3只三角瓶，然后于37℃培养箱中保温培养24 h。培养效果：FBKL1.0199菌液呈黄色，浑浊，液面布满白色菌膜，微粉色，摇瓶后菌膜似蛋花样聚在一起，类似臭鸡蛋气味。FBKL1.0201液体呈黄色，浑浊，液面布满白色菌膜，摇瓶后菌膜散浮于液面，稍臭，有豆豉味，空瓶略显焦香味。

浅盘培养：灭菌后扬麸摊晾至45℃以下，接入液体三角瓶，拌匀于37℃培养箱中保温培养48 h，培养结束，闻之有氨味。

帘子种曲培养：按10%的比例接入浅盘曲种，拌匀。接种后上帘培养，曲料厚1～1.5 cm，厚薄均匀。摊料结束将已灭菌的薄膜盖在上面。控制室温在37～40℃，品温37～50℃，可采用划帘和调整室温以控制品温。接种30 h，生长旺盛，可揭去薄膜，培养48 h后，曲种出现刺鼻的氨味，将室温控制至40℃进行排湿干燥。

通风曲培养：将小麦散冷至40～50℃，按5%的比例接入种曲拌匀。小麦装箱后进入静置培养，控制室温40℃，品温37～45℃，12 h后翻曲1次，控制品温40～55℃之间。24 h和36 h后各翻曲1次，控制品温45～60℃之间。约48 h出房。成曲有刺鼻的氨味，并拌有豆豉味。

2.3 强化酱香纯种麦曲理化指标

强化酱香纯种麦曲的理化指标测定结果如表1所示。

表1 麦曲理化指标

对照地方标准DB 52/T871—2014《酱香型白酒酿酒用大曲》检测分析指标。由表1可知，麦曲中水分含量、酸度均符合酱香型大曲成品曲的指标要求，水分、酸度在规定范围内（水分≤13%，酸度1.0～3.5 mmol/10 g）。对原料小麦的淀粉的利用率在12.38%～16.44%之间。其中，淀粉含量、糖化力标准中的规定范围：淀粉含量53.0～60.0 g/100 g，糖化力100～300 U，实际测得值偏小。液化力能力很低。这很有可能是因为麦曲在制作过程中菌种太过单一，其中芽孢杆菌的菌落总数为2.24×108cfu/g。

2.4 GC-MS实验结果

将接入功能性菌株发酵的麦曲混合后进行HS-SPME结合GC-MS分析。麦曲GC-MS总离子图见图2，成分分析见表2、图3。

由表2、图3可知，麦曲中共检测到10种物质，醛类物质1种，酮类物质1种，醇类物质2种，酸类物质4种，吡嗪类物质2种。其中酸类物质百分含量最高，为39.29%，其次是吡嗪类化合物相对百分含量，为32.8%，其中以四甲基吡嗪为主，含量为31.11%。其次是醇类化合物，含量为25.64%，醛类物质和酮类物质含量较低，分别为0.53%和0.33%。还有一些其他的烷烃类、杂环类和未确定的化合物，总含量为1.41%。

图2 麦曲GC-MS总离子流图

表2 麦曲GC-MS成分分析

图3 麦曲挥发性成分百分含量图

3 结论

本研究将从高温酱香大曲中分离所得到的功能性地衣芽孢杆菌直接加入到小麦里，经过高温发酵，使得地衣芽孢杆菌在小麦里形成生长优势，得到纯种麦曲。所制得的麦曲中地衣芽孢杆菌数量为2.24×108cfu/g。同时测定了麦曲的理化指标，发现所制得麦曲酯化力强，但糖化力和液化力偏低。对麦曲的风味成分进行了HS-SPME结合GC-MS分析，证实麦曲中的风味成分以吡嗪类物质为主，吡嗪类物质所占的相对百分含量为32.8%，其中四甲基吡嗪的含量为31.11%。