红心猕猴桃酒异步发酵工艺的研究

陈 林，秦文飞，吴应梅，顾 欣，田海燕，李 迪

（1.重庆市生物与食品基础实验教学中心，渝东北特色生物资源开发利用工程中心，重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆万州404100； 2.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093； 3.海南大学食品学院，海南海口570228）

红心猕猴桃属中华猕猴桃的红肉猕猴桃变种[1-2]，其果肉质地紧密细嫩，香气浓郁，果心呈鲜红色。红心猕猴桃属于皮薄多汁浆果[3]，并且对乙烯很敏感，成熟后极易腐烂变质，不能长期贮藏。果实采收后若储藏、运输方式不当会极易使猕猴桃变软腐烂，这严重影响到红心猕猴桃种植业的发展。近年来，随着人们生活水平的不断提高和对营养健康的追求，红心猕猴桃果酒低酒精度、营养健康养生的特性更受到人们的欢迎。

本实验对红心猕猴桃果酒异步发酵工艺进行探究[4-6]，采用猕猴桃果浆全发酵，在添加酵母的基础上利用乳酸菌进行二次发酵增进风味[7-8]，探究一种红心猕猴桃异步发酵酒制备方法，提高果酒的营养质量和口味，以期充分开发我国的红心猕猴桃资源[9]，进一步研究其深加工技术，提高农产品经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红心猕猴桃，重庆万州走马镇双河杜家村金泽农业有限公司种植基地，其品种为红阳[10]；酵母菌、果胶酶，烟台帝伯仕自酿机有限公司；乳酸菌，北京川秀科技有限公司；糖化酶，诺维信生物技术有限公司；柠檬酸，郑州特征商贸有限公司；甲醇（标准品），北京胜达惠友科贸有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent Technology 7890B气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；DHP-9080恒温培养箱，济南来宝医疗器械有限公司；PHB-10酸度计，上海虹益仪器有限公司；HT511ATC酒精计，北京金时速仪器设备有限公司；日本爱拓PAL-1可溶性固形物测定仪，北京阳光亿事达贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红心猕猴桃果酒制作流程

原料洗净，削皮→果肉打浆→低温灭菌→调节pH值、糖度→加入果胶酶、糖化酶、酵母和乳酸菌→搅拌→避光发酵→发酵液过滤→滤液乳酸菌发酵→陈酿→灭菌→装罐

挑取无病虫害，八成熟的新鲜红心猕猴桃，清洗干净后进行破碎打浆。然后果浆在65～70℃水浴中灭菌15～20 min，接着依次添加0.5%果胶酶、0.4%糖化酶、0.5%酵母充分搅拌混匀，调整pH值后，25℃恒温箱内进行发酵。初次发酵6 d后过滤再添加乳酸菌增加猕猴桃酒的风味和质量，最后对发酵完成的红心猕猴桃果酒过滤，陈酿。

1.3.2 单因素实验设计

（1）乳酸菌接种量对红心猕猴桃果酒的影响称取800 g红心猕猴桃果浆，在发酵温度25℃，酵母菌接种量为0.5%，初始pH3.50，初始糖度为23%的条件下避光发酵6 d，然后过滤等量分成5份依次加入1%、3%、5%、7%、9%的乳酸菌进行第二次发酵，发酵温度25℃。每两天测量其酒精度并在发酵结束后对果酒进行感官评价。

（2）初始糖度对红心猕猴桃果酒的影响

称取800 g红心猕猴桃果浆，发酵温度25℃，加入酵母0.5%，初始pH值为3.50，平均分成5份用蔗糖调整糖度为17%、20%、23%、26%、29%。避光发酵6 d后加入5%的乳酸菌进行第二次发酵。每两天测量其酒精度并在发酵结束后对果酒进行感官评价。

（3）pH值对红心猕猴桃果酒的影响

称取800 g红心猕猴桃果浆，发酵温度25℃，加入酵母0.5%，初始糖度为23%，平均分成5份用小苏打调整pH值为2.90、3.20、3.50、3.80、4.10。避光发酵6 d后加入5%的乳酸菌进行第二次发酵。每2天测量其酒精度并在发酵结束后对果酒进行感官评价。

1.3.3 正交实验设计

为获得理想工艺参数，在单因素实验结果的基础上，选择乳酸菌接种量、发酵糖度和pH值3个因素，设计L9(34)正交实验对红心猕猴桃酒进行优化（表1），从而确定最优工艺条件。

表1 正交实验因素及水平表

1.3.4 红心猕猴桃酒感官评定标准

感官评分主要分为外观、香气、口感和整体感觉[11]，总分为100分，各指标分别评分，取各指标和为总分。评分标准表见表2。

1.3.5 甲醇的测定

准确称取甲醇500 mg、乙酸乙酯400 mg，以少量水洗入50 mL容量瓶中，并加水稀释至刻度，混匀，准确吸取上述溶液1.0 mL至10 mL容量瓶中，用10%无甲醇的乙醇溶液定容至刻度，混匀。准确吸取上述溶液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL于10 mL容量瓶中，用10%的无甲醇的乙醇溶液定容至刻度，混匀后与式样分别上机测定，根据标准溶液校正曲线计算出试样的甲醇含量[12-15]。

表2 红心猕猴桃酒感官评定标准

气相色谱条件：色谱柱为Agilent cp97753 cp-Wax 57cb（50 m×0.32 mm×0.2 μm）；升温程序35 ℃（2 min）；分流比40∶1；进样口温度180 ℃；检测器温度250℃；载气N2（纯度99.999%）。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌接种量、糖度及pH值对发酵的影响（图1）

红心猕猴桃酒中的酸主要为有机酸，能够对果酒产生酸涩的口感，乳酸菌对有机酸（特别是苹果酸）的降解有明显作用，从而改善和提高果酒风味[16]。由图1（A）看出，随着乳酸菌接种量增加，果酒中pH值呈上升趋势，由此得出乳酸菌接种量越大，果酒中的苹果酸等有机酸越能有效地被分解，从而降低果酒中酸度，提升果酒的感官品质。感官分析表明，乳酸菌接种量为5%左右时，感官评分最高。

红心猕猴桃含糖量与酵母繁殖、发酵的关系很密切，果浆中的糖是酵母菌生长繁殖的碳源。由图1（B）看出，初始糖度为23%、26%时，果酒酒体醇厚、果香浓厚、感官评分较高；初始糖度超过26%时，酒精度呈急速下降趋势，蔗糖添加量过高，导致体系的渗透压过高，不利于酵母生长。综合评价选择糖度23%作为正交实验的较优水平。

红心猕猴桃果汁原始酸度一般不适合酵母的生长和发酵。在微酸环境下，酵母菌生长、繁殖和发酵都很迅速。如图1（C）所示，pH值为3.20时，所酿的果酒感官评分最高，从不同pH值条件的酒精度随时间的变化趋势图可知，pH值在3.50左右时，酒精度变化趋势较稳定，果酒酸甜适中、醇厚酯香。因此综合评价选择pH值在3.50左右为正交实验的较优水平。

2.2 红心猕猴桃发酵工艺正交实验结果分析（表3）

由表3可知，各因素对综合评分的影响由主到次为初始pH值＞乳酸菌接种量＞初始糖度，其组合最佳为A2B2C1，即乳酸菌接种量为5%，初始糖度为23%，pH值为3.20。根据最佳组合重新酿造红心猕猴桃酒呈黄绿透亮色，有清甜的猕猴桃果香，口感酸甜细腻，酒味适中；经过杀菌处理后低温避光能储存6个月以上，通过气相分析测得酒样甲醇含量低于检出限。

表3 正交实验结果

3 结论

单因素实验中，乳酸菌接种量越多，越能够明显降低果酒中的酸度，增加果酒的口感，但从酒精度和整体的感官评价来看，乳酸菌接种量在5%时，酒精度和感官评分最高；初始糖度越大，会导致发酵体系中的菌种因为渗透压过高影响发酵；由总评分可以看出，初始pH值为3.20时酿造的果酒的酒精度和感官评价较好。

正交实验结果中，pH值对猕猴桃酒的发酵影响最大，主要是因为发酵菌种对发酵环境很敏感，在适宜的微酸的条件下，菌种的生长、繁殖和发酵速度都很迅速；其次为乳酸菌的接种量，因为乳酸菌能明显降低果酒中的果酸，从而增加果酒的感官效果，乳酸菌接种量为5%时，果酒有更好的口感和风味；初始糖浓度对菌种生存起着关键作用，适宜的糖浓度有利于微生物的生长繁殖，增加果酒的风味。因此本实验得到的最佳工艺参数为乳酸菌接种量为5%，初始糖度为23%，pH值为3.20。