不同种类浒苔多糖的体外抗菌活性研究

杜恒裔， 刘浩民， 邹 玲， 李桂梅， 王述柏*

（1.青岛农业大学，山东青岛 266109；2.山东海阳市畜牧兽医局，山东海阳 265100）

畜禽养殖业抗生素禁用已成大势所趋，抗生素替代品的研发成为目前养殖行业亟待解决的课题。大量研究显示，植物多糖类具有抗菌、抗病毒、增强动物免疫功能等作用。有研究表明，1%的茯苓多糖对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，0.05%的茯苓多糖对大肠杆菌有一定的抑制作用（安玉山等，2016）。3.2%香菇多糖 （纯度为42.15%）对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定抑制作用（路志芳等，2017）。据报道，南非海洋巨藻水提多糖具有抑菌活性（Vlachos等，1997）。韩玲等（2013）研究发现肠浒苔提取物对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有一定的抑制作用。高玉杰等（2013）研究硒化浒苔多糖和未经硒化浒苔多糖的抑菌效果，发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效果，硒化浒苔多糖的抑菌效果优于未经硒化浒苔多糖，且抑菌效果随浓度增加而增强。本试验研究了自青岛沿海生长的浒苔（Enteromorpha prolifera）提取物——一种以鼠李糖为主要成分的浒苔多糖（多糖含量为47.5%，以下称为浒苔多糖1）及一种结构上硒化的浒苔多糖（硒含量15%，多糖含量32%）的体外抑菌活性，旨在为其在畜禽养殖业中的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 待检材料 浒苔多糖1：经实验室检测，其粗多糖（以鼠李糖计）含量为47.45%，粗多糖分子量600～6000 Da，粗蛋白质含量为4.82%，含水量2.9%。

硒化浒苔多糖：对浒苔多糖1进行硒化处理，其硒含量为15%，粗多糖（以鼠李糖计）含量32%。

上述两种多糖均由青岛海大生物公司提供。

1.1.2 试验毒种 O157型大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌均来自青岛农业大学动物医学院菌种库。

1.1.3 对照样品 酵母细胞壁多糖 （25%β-葡聚糖和25%甘露糖）、黄芪多糖（纯度45%）、45%硫酸黏杆菌素粉、林可霉素原粉。

1.2 试验方法 采用药敏试验检测浒苔多糖1、浒苔多糖硒对O157型大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈（胡桂学，2015）。

1.2.1 培养基的配置 琼脂培养基：称量琼脂糖1.0 g、氯化钠 8.0 g、苯酚 0.1 mL、蒸馏水 100 mL；先将琼脂糖加到蒸馏水中，加热融化后再加入氯化钠、苯酚，最后用5.60%NaHCO3调节pH至6.8～7.2。随后放入121℃高压锅灭菌15 min，灭菌后倒琼脂平板，冷凝备用。

LB肉汤培养基：称取LB肉汤粉52 g溶于1000 mL蒸馏水，121℃高压灭菌15 min冷却后使用。

1.2.2 待检样品处理 不同浓度浒苔多糖粗提物、浒苔多糖硒溶液的配制：将粉剂的浒苔多糖粗提物、浒苔多糖硒分别用蒸馏水配制成10、20、50、100 mg/mL浓度的待测溶液。

林可霉素（粉剂）、硫酸黏杆菌素（粉剂）待测液的配制：分别用蒸馏水配制成50 μg/mL硫酸黏杆菌素，75 μg/mL林可霉素。

黄芪多糖、酵母细胞壁多糖待测液的配制：分别用蒸馏水配制成10、20、50、100 mg/mL待测溶液。

上述待测溶液除抗生素溶液外均采用高压锅在121℃温度下灭菌15 min，冷却待测。

1.2.3 含药纸片的制备 将灭菌纸片用镊子摊布于平皿中，以每张滤纸片饱和吸水量0.01 mL计，取10张滤纸片加入药液0.1 mL，翻动滤纸片，使滤纸片将药液均匀吸净，浸泡30 min使药敏片充分吸取药液。然后将滤纸片放入灭菌平皿转入37℃温箱中烘干，烘烤时间4 h，抗生素药敏片烘烤2 h。干燥后的药敏片，放入灭菌窄口瓶中，贮藏于-20℃冰箱冰冻待用。使用前将滤纸片从冰箱取出室温放置1 h后使用。

1.2.4 细菌的分离培养 冷冻菌株室温融化后，在超净台用接种环（酒精灯消毒后冷却）取少量菌液采用四区画线涂板法接种于配制好的琼脂培养基上，37℃培养箱中倒置培养48 h，挑取单菌落，放入5 mL LB肉汤培养基中，37℃恒温摇床继续培养5 h，取100 μL滴于琼脂培养基上，用玻璃涂布器涂匀，盖好平皿，置室温干燥5 min后，放置含有样品的药敏纸片。

1.2.5 抗菌活性检测 用灭菌镊子取出含药纸片小心贴在涂有大肠杆菌菌液的琼脂培养基表面。在直径9 cm培养皿中，贴7张药敏片，1张贴于中心，其余6张均匀贴于四周，距平皿边缘1.5 cm。轻轻按压贴片，确保药敏纸片与琼脂板之间无空隙。将平皿倒置放于37℃恒温箱，培养24 h后观察含药纸片周围有无抑菌环产生，量取抑菌圈直径（包括纸片直径）。对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性检测方法同大肠杆菌。

1.2.6 结果判定 参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）抑菌活性判定使用标准，抑菌圈直径（d）≤6 mm， 药物敏感度判定为 -；6 mm＜d≤10 mm，药物敏感度判定为+；d≤16 mm，药物敏感度判定为++；d≤26 mm，药物敏感度判定为+++；d＞26 mm，药物敏感度判定为++++。药物敏感度在++以上判定为具有抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 浒苔多糖粗提物的体外抑菌活性 由表1可看出，10～100 mg/mL浓度的浒苔多糖粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未产生抑菌活性。林可霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性（++），硫酸黏杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌均有抑菌活性（++）。

表1 浒苔多糖粗提物的抑菌圈和抑菌活性

2.2 浒苔多糖硒的体外抑菌活性 由表2可知，50 mg/mL的浒苔多糖硒对金黄色葡萄球菌抑菌圈8 mm （+），100 mg/mL的浒苔多糖硒对金黄色葡萄球菌抑菌圈为18 mm（++），各浓度的浒苔多糖硒对大肠杆菌、沙门氏菌均无抗菌活性。林可霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性（++），硫酸黏杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌均有抑菌活性（++）。

表2 浒苔多糖硒的抑菌圈和抑菌活性

3 讨论

3.1 浒苔多糖粗提物的体外抗菌活性 对于浒苔多糖的抗菌活性国内外报道较少。Rizvi等（2000）对巴基斯坦海岸的26种藻类进行抗菌活性筛选试验发现，肠浒苔对多种真菌具有抑制活性。Mehrtens（1994）研究发现，扁浒苔具有抑菌活性，其机理可能与其碘代过氧化物酶活性高有关。高玉杰（2013）报道，浒苔多糖浓度为6.80 mg/mL时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制。本试验结果显示，10～100 mg/mL浓度的浒苔多糖粗提物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未产生抑菌作用，与高玉杰的研究结果不一致，其原因可能与本试验所用样品浒苔多糖的含量低（47.45%）有关。

3.2 浒苔多糖硒的体外抗菌活性 据报道，硒具有清除自由基、提高动物免疫能力等作用，硒多糖具有硒与多糖的双重功效，在抗氧化、抗肿瘤等方面具有独特的生物活性（高玉杰等，2012）。另据报道，硒含量为512.3 μg/g的硒化浒苔多糖浓度为1.70 mg/mL时，可完全抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长（路则庆，2014）。本试验结果显示，浒苔多糖硒浓度为100 mg/mL时对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌作用。本试验结果与上述报道的不一致，可能与样品的纯度太低有关。

4 小结

本试验结果表明，浒苔多糖粗提物浓度为10～100 mg/mL时对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未产生抑菌作用，浒苔多糖硒浓度为100 mg/mL时对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌作用。