发酵玉米蛋白粉饲料的枯草芽孢杆菌紫外诱变选育

王 松 ， 江成英 *， 郑喜群 ， 刘晓兰 ， 许红丽 ， 董 楠 ， 张忠月

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

玉米蛋白粉饲料作为蛋白质饲料中重要的一种，由于其中含有大量蛋白质成分被广泛应用（林谦等，2013），但是其中的蛋白质大部分为醇溶蛋白不能被动物吸收与利用。通过微生物发酵的方法可降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白，能够显著提高玉米蛋白粉饲料的利用率 （江成英等，2018）。本研究通过紫外线诱变育种的方法来筛选得到产蛋白酶活力有明显提高的枯草芽孢杆菌（王雅君等，2013），用以发酵玉米蛋白粉饲料，以期提高玉米蛋白粉饲料的醇溶蛋白降解率，进而提高其动物利用率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本试验采用的菌种为齐齐哈尔大学生物工程实验室保藏的枯草芽孢杆菌。

1.1.2 实验仪器 紫外可见分光光度计（日本岛津仪器厂），电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂），高速离心机 （北京京立离心机有限公司），PHS-25数显pH计 （上海精密科学仪器有限公司），BS224S型电子天平 （北京赛多利斯仪器厂），ZD-8801振荡器（太仓科教器材厂），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），超净工作台（上海智城分析仪器有限公司），旋涡混合器（北京市金北德工贸易有限公司）等。

1.1.3 培养基 LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉5%，氯化钠 1%，pH为7.0。固体培养基加入2%的琼脂。121℃灭菌30 min；脱脂牛奶培养基：A：5 g脱脂牛奶与 50 mL蒸馏水混合；B：2 g琼脂溶于50 mL蒸馏水。A，B分别115℃灭菌20 min，冷却至60℃混匀后倒平板。

1.2 方法

1.2.1 菌种生长曲线测定 由于菌悬液中的菌体浓度在一定范围内与菌悬液浑浊度成正比，所以采用比浊法测定原始菌株的生长曲线 （朱艳蕾，2016）。

1.2.2 致死率曲线测定 制备菌悬液，使用紫外灯对菌悬液进行不同时间（0～90 s）的照射，每隔5 s进行一次取样，稀释之后进行平板涂布。将平板倒扣培养进行菌落计数，绘制致死率曲线。

1.2.3 突变株的筛选 将诱变处理后的菌株涂布于脱脂牛奶平板上。计算透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出产蛋白酶活力较强的菌株。

1.2.4 酶活力测定 蛋白酶活力采用福林酚法进行测定。

1.2.5 传代稳定性试验 将筛选出的菌株传代并测定其酶活，评定该突变菌株的遗传稳定性（刘天祎，2017）。

1.2.6 发酵验证试验 将诱变获得的菌株11-1接入玉米蛋白粉中进行固态发酵，以验证其对玉米蛋白粉饲料的发酵能力。

2 结果与分析

2.1 原始菌种的生长曲线 进行紫外诱变处理时，一般要求诱变菌种应处于对数生长期，此时的菌种对于紫外线更敏感，更容易发生突变，而且处于对数生长期的菌种代谢能力强，相对稳定，生长速度快繁殖旺盛，易于做重复试验。

由图1所示，0～4 h期间菌体浓度几乎无变化，此时菌种处于生长适应期。从5 h开始菌种出现迅速增长，可知原始菌种的对数生长期为5～24 h，24 h后菌种生长速度减缓，进入稳定期，进行紫外诱变时应选择对数中前期的菌种进行诱变，所以选择经过14 h培养的菌悬液进行紫外诱变处理。

图1 枯草芽孢杆菌生长曲线

2.2 致死率曲线 进行紫外诱变育种时应当选择使菌种致死率达到80%的紫外光照射时间为最佳诱变剂量。当菌种致死率达到80%，菌种的变异概率大，更易发生突变。

如图2所示，随着紫外照射时间的增加，菌种的死亡率逐渐增加，当照射时间达到55 s时，致死率达到79.62%，当照射时间达到70 s时菌种死亡率达到100%。因此采用55 s为最佳诱变剂量进行下一步诱变育种试验。

图2 枯草芽孢杆菌致死率曲线

2.3 高产蛋白酶突变菌株筛选 根据脱脂牛奶筛选培养基上透明圈直径与菌落直径的比值，筛选出5株产蛋白酶活力较强的菌株，结果见表1。

表1 高产蛋白酶突变菌株筛选结果

其中突变株11-1的透明圈直径与菌落直径比值与原始菌株相比变化最大，达到10.86，该透明圈与菌体直径的比值表示该菌种产蛋白酶对蛋白质的水解能力，透明圈与直径比值越大则说明该菌株产蛋白酶活力越大。经过测量之后发现11-1的比值与原始菌株相比有明显提高，则说明经过紫外诱变育种之后原始菌株的产蛋白酶能力得到了明显的提高，较原始菌株透明圈与菌落直径比值6.67相比提高了约1.63倍。

2.4 突变菌株的酶活力测定 将筛选出的突变株接入液体LB培养基中培养，取培养液离心取其上清液测定酶活力。

如表2所示，筛选出的5株突变株中，突变株11-1与22-4产蛋白酶活力相差不多，11-1相对更高，所以选用11-1进行下一步遗传稳定性试验。11-1产蛋白酶活力较原始菌株21.515 U/mL提高最大，数值达到35.301 U/mL，说明原始枯草芽孢杆菌经过紫外诱变育种之后产蛋白酶能力得到了明显的提升，较原始菌株提高了约1.66倍。

表2 突变株蛋白酶活力U/mL

2.5 遗传稳定试验 对突变株11-1进行连续传代培养，验证其遗传稳定性，结果见表3。

表3 突变株11-1的遗传稳定性U/mL

对突变菌株11-1连续传代8次，其蛋白酶活力基本稳定。传代第八次与原始菌株的酶活力相比有所降低，变化约为4.8%，变化幅度不显著，证明连续传代会对突变菌株11-1的产蛋白酶活力造成一定影响，但影响程度不大，可以认为高产蛋白酶突变株11-1遗传性能良好，可做为发酵玉米蛋白粉饲料菌株。

2.6 发酵验证试验 将诱变所得对玉米蛋白粉进行发酵试验，以验证其发酵能力。将玉米蛋白粉和麸皮以 7∶3混合，料水比为 1∶1.2，接入 5%的11-1菌株，置于30℃发酵84 h，测定其可溶性蛋白含量，结果见表4。

表4 突变株11-1与原始菌株发酵能力比较%

由表4可知未经发酵的原料中可溶蛋白含量为3.97%，经过原始菌株发酵的饲料可溶蛋白含量为6.34%，可溶蛋白含量转化率为37.39%。经过突变菌株11-1发酵的饲料中可溶蛋白含量为7.61%，可溶蛋白含量的转化率为47.83%。可以看出经突变菌株11-1发酵过后的玉米蛋白粉饲料中的可溶蛋白含量较原始枯草芽孢杆菌相比有明显提高。可以得出结论突变菌株11-1经紫外诱变后有更好的降解饲料能力，经11-1发酵过后的饲料能够更容易被吸收，提高了玉米蛋白粉饲料的利用率，具有良好的发展前景。

3 结论

使用枯草芽孢杆菌所产生的蛋白酶在各个行业均已被大量应用（Schallmey等，2004）。本研究通过紫外诱变育种筛选出一株遗传性状稳定的较原始菌株产蛋白酶能力有明显提高的枯草芽孢突变菌株11-1。经测定该菌株的透明圈直径比值为10.86，较原始菌株扩大1.63倍；蛋白酶活力为35.301 U/mL，较原始菌株的蛋白酶活力提高1.66倍。通过连续传代试验发现其蛋白酶活力变化率为4.8%，变化幅度不显著，证明其遗传性能稳定。发酵试验表明，经突变菌株11-1发酵的玉米蛋白粉中可溶蛋白转化率为47.83%，较未诱变的原始菌株提高了10.44%。表明紫外诱变育种技术能够有效的提高枯草芽孢杆菌的产蛋白酶能力，并且能够稳定遗传，可用于发酵玉米蛋白粉饲料的生产，为微生物发酵生产玉米蛋白粉饲料奠定了基础。