超高效液相色谱-串联质谱法检测饲料中喹烯酮和喹乙醇

刘雪红， 宋 平， 孙进健

（大连市兽药饲料监察所，辽宁大连 116037）

目前，饲料中喹乙醇与喹烯酮的检测方法主要有酶联免疫分析法（赵春保等，2008）、高效液相色谱法（刘发全等，2008）、高效液相色谱-串联质谱法 （2349号公告-6，2015；2086号公告-5，2014）。免疫分析法样品前处理简单、检测速度快，但容易产生假阳性或假阴性的结果；液相色谱法灵敏度较低，检出限较高；液相色谱—串联质谱法是应用较广泛的检测饲料中喹 啉类药物的方法。文献报道较多的是采用HLB固相萃取柱净化，样品前处理需配制多种试剂，操作步骤多，而且净化所用固相萃取柱使用前需活化，备用液过柱后，需淋洗。整个前处理过程较长，费时费力。本文采用PRiME HLB固相萃取柱净化，Atlantis T3色谱柱分离，仅需配制1种试剂，无需氮吹，且所用的固相萃取柱无需活化和淋洗，分析速度快、回收率高，能满足定性、定量的要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 电子天平RD-200，德国Sartorius公司；超声波清洗器 KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司；立式低温高速离心机CF16RN，日立公司；数显强力涡旋混合器 MS3，德国 IKA公司；液相色谱质谱联用仪UPLC XEVO TQ-S，美国Waters公司；色谱柱 Atlantis T3（2.1 mm×150 mm 5μm），美国Waters公司；色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm 1.7μm），美国Waters公司；固相萃取柱 Oasis PRiME（HLB 3 mL 60 mg）。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品 喹乙醇批号H0061103，含量99.5%；喹烯酮 批号H0561305，含量99.6%，均来自中国兽医药品监察所。

1.2.2 供试品

1.2.2.1 空白样品 乳猪配合饲料：辽宁禾丰牧业股份有限公司，经检测不含喹乙醇和喹烯酮。

1.2.2.2 空白添加样品 分别按照0.2、0.4、2 mg/kg的比例在空白样品中添加喹乙醇和喹烯酮标准品，混匀。

1.2.3 试剂 甲醇、乙腈、甲酸色谱纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

0.1%甲酸溶液：量取1.0 mL甲酸与1000 mL水，混匀。 0.1%甲酸-乙腈（2+8）溶液：量取200 mL 0.1%甲酸溶液与800 mL乙腈，混匀。0.1%甲酸-乙腈（8+2）溶液：量取 800 mL 0.1%甲酸中溶液与200 mL乙腈，混匀。

1.2.4 混合标准贮备液（1000 μg/mL） 分别准确称取喹乙醇和喹烯酮对照品各10 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加2 mL二甲亚砜溶解，并用甲醇定容。-20℃密封避光保存，有效期为3个月。

1.2.5 混合标准工作液配制（10 μg/mL） 精密量取1.2.4项下混合标准贮备液1 mL用乙腈稀释定容100 mL。-20℃密封避光保存，有效期为3个月。

喹烯酮和喹乙醇均对光敏感，见光易分解，所以在整个实验过程中必须避光操作，所用的器皿应尽可能采用棕色。

1.3 样品检测

1.3.1 样品处理

1.3.1.1 提取 称取2.00 g试样 （精确至0.01 g），于聚丙烯离心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液（2+8）20 mL， 涡动 1 min，40℃ 超声波清洗仪中超声10 min。9000 r/min下离心15 min，备用。

1.3.1.2 净化 精密量取1 mL上清液，直接过PRiME HLB固相萃取柱，收集全部流出液，精密量取3 mL水与之混匀，过0.22 μm滤膜供上机检测。

1.3.2 液相色谱条件 色谱柱：Atlantis T3，柱温：30℃，进样量：5 μL，梯度洗脱程序见表 1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 质谱条件 离子扫描方式：正离子，检测方式：多反应监测，雾化器压力：7.0 Bar，干燥气流量：650 L/h，干燥气温度：400℃，毛细管电压：3000 V定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量见表2。

表2 定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量

1.3.4 标准曲线绘制 精密量取1.2.5混合标准工作液逐级稀释，以1.2.3.3稀释液定容配制成浓度分别为 5、20、80、200、500 ng/mL 标准曲线溶液，混匀后上机测定。

2 结果

2.1 标准曲线 以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准曲线。2种药物在5～500 ng/mL时线性关系良好，相关系数均在0.996以上（表3）。

表3 2种药物的标准曲线及相关系数

2.2 检测限和定量限 添加适量混合标准工作液于空白饲料中，经提取后测定。根据特征质量色谱峰的信躁比S/N＞3为检测限，信躁比S/N＞10为定量限，检测到2种药物的检测限为0.06 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。空白饲料中添加0.2 mg/kg的2种药物特征离子质量色谱图见图1。

图1 空白饲料中添加0.2 mg/kg的2种药物特征离子质量色谱图

2.3 回收率及重复性实验 在空白饲料中添加3个不同浓度（0.2、0.4、2 mg/kg）2 种药物，进行回收率实验，每个添加浓度做5个平行，连续测定3批，其平均回收率、相对标准偏差见表4。从表中实验结果可以看出2种药物的添加回收率为80%～95.5%，批内批间相对标准偏差均小于10%。

3 讨论

3.1 选用Atlantis T3色谱柱分离，2种药物峰形均良好。见图1。采用C18色谱柱分离，喹烯酮峰形良好，喹乙醇受基质干扰，峰形很差，见图2。

3.2 采用目前的方法进行检测，与文献中报道的液相色谱质谱法比较，减少试剂的使用及操作步骤，节省试剂和时间，提高了检测效率。前处理方法比较见表5。

表4 2种药物回收率及重复性实验结果（n=5）

图2 2种药物（添加0.2 mg/kg）采用BEH C18色谱柱分离特征离子质量色谱图

3.3 基质效应研究 由于液相色谱-串联质谱存在基质效应，而且饲料样品基质复杂，因此对样品基质效应进行研究。比较3个不同条件下的信号峰面积：纯的标准品溶液，样品基质提取后添加，样品基质提取前添加。在优化实验条件下，用空白样品按“1.3.1”方法制作空白基质，加入一定量标准溶液，制成基质标准溶液；在空白样品中加入一定量标准溶液，按“1.3.1”方法制成基质匹配标准溶液；与相应浓度的纯标准溶液比较。实验结果发现，无明显基质效应，因此定量时采用纯的标准品曲线。

表5 2种前处理方法比较

4 结论

该检测方法，定量限为0.2 mg/kg，在0.2、0.4、2 mg/kg添加水平下，喹乙醇和喹烯酮平均回收率为80%～95.5%，相对标准偏差均小于10%。实验流程更简单、更快速、更有效，适合大批量日常分析检测。