苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析

杨雪梅，范 雪，田可川，黄锡霞，朱 桦，阿布来提·苏来曼，陈华峰，何军敏，赵冰茹，徐新明，付雪峰，田月珍，吴伟伟，哈尼克孜·吐拉甫，杜建文

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】苏博美利奴羊是通过系统选育而成的羊毛细度为17.0～19.0 μm精纺用超细毛羊新品种，该品种成年公羊和母羊肩胛部平均羊毛细度的最细记录分别为16.42、17.85 μm[1]。羊毛的生长发育与毛囊的结构和特性密切相关，中国超细毛羊(甘肃型)在胎龄138 d时，大部分初级毛囊与部分次级毛囊发育成熟[2]。而苏博美利奴羊在胚胎期65 d，初级毛囊形成；在胚胎期85 d次级毛囊形成；在胚胎期105 d次级获得性毛囊形成；在胚胎期135 d，毛囊基本成熟[3]。【前人研究进展】羊毛的品质及其商业价值是由毛囊的结构和特性决定，若想要提高羊毛的品质及产量，要研究其毛囊的发生发育，增加与毛囊发育有关基因的功能了解，才能更好的提高羊毛的质量与产量。在毛囊发育过程中，几种分泌的信号分子家族涉及表皮和真皮之间的通信[4-5]。其中，WNT家族似乎是表皮早期发育的最早和最关键的调节因子[6]。WNT2基因是WNT家族的成员之一，与肿瘤的形成与转移[7]。有研究表明，WNT2基因在细胞的生长、增殖过程中起重要作用[8]。此外，Fu J等[6]不仅确定了产生WNT的细胞类型，还揭示了在毛囊形态形成的不同阶段WNT信号的高度调节动态。推测WNT2基因可能是绵羊毛囊发育的潜在关键基因。【本研究切入点】在过去的几年里，已经对该品种进行了毛囊结构[3]、表达分析[9-10]及产毛性状[11]的研究，调节羊毛生长的分子机理尚未完全了解。毛囊发育相关基因的表达研究、转录因子预测分析及生物信息学分析可能是阐明羊毛生长分子调控机制的另一种策略。【拟解决的关键问题】采用qRT-PCR法对苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达进行研究，使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子，并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化，使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性，并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。为了解苏博美利奴羊WNT2基因的分子结构和进化特征奠定基础，进一步揭示WNT2基因在羊毛性状调控中的作用。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

从新疆科创繁育中心采集3只2周岁左右健康无病、体况均匀的经产苏博美利奴母羊(平均纤维直径约17.73 μm)胚胎期135 d(毛囊成熟时期)左侧肩胛部皮肤组织及心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织。将各组织样本保存于液氮中，且均为3个生物信息学重复。

1.1.2 主要试剂

EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox购自ABM(加拿大)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser购自TakaRa公司(日本)、DL 2000 DNA Marker与6×Loading Buffer购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成

取组织样品50～100 mg于液氮中研磨，使用Trizol法对苏博美利奴羊的7个组织样品进行总RNA的提取。使用核酸检测仪检测其浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；将检测合格的总RNA根据反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。

1.2.2 引物设计与合成

根据NCBI上公布的绵羊WNT2基因(GenBank NO. NM_001195319.1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank NO. NM_001190390.1)的序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，最后由上海生工生物工程有限公司合成。表1

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 实时荧光定量PCR检测

以cDNA为模板，对目的基因WNT2进行PCR扩增，反应体系为25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序为95℃ 3 min，94℃ 30 s，63℃ 45 s，35个循环，72℃ 5 min。随机选择4个PCR产物取2 μL与3 μL的6×Loading Buffer混匀，经2%琼脂糖凝胶180 V电泳25min，以DL2000为Marker来标记产物片段的大小；之后使用凝胶成像仪进行照胶，若获得的产物片段与预期片段大小一致，可进行下一步试验。

实时荧光定量PCR以苏博美利奴羊不同组织反转录的cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因进行，反应体系为20 μL：EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反应程序为95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，共40个循环，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每个样品均为3个生物信息学重复。

1.2.4 转录因子的预测、核苷酸组成及密码子偏好性

下载NCBI上公布的绵羊WNT2基因启动子区域序列，使用在线软件PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi dirDB=TF_8.3)对该基因进行转录因子的预测，并用Cytoscape_v3.5.1软件进行可视化；使用MEGA 7.0软件估计绵羊WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成及密码子偏好性分析。

1.2.5 系统进化树的构建

下载NCBI上公布的绵羊(Sheep)、山羊(Goat)、牛(Bos taurus)、人(Human)、马(Horse)、猪(Pig)、恒河猴(Rhesus monkey)、北白颊长臂猿(Northern white-cheeked gibbon)、苏门答腊猩猩(Sumatran orangutan)、兔(Rabbit)、家鼠(House Mouse)等11个物种的WNT2基因的DNA序列，使用MEGA 7.0软件进行多序列比对，构建系统进化树。

1.3 数据处理

苏博美利奴羊不同组织中目的基因WNT2基因与内参基因GAPDH基因的相对表达量采用2-△△Ct方法进行计算，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt目的组-ΔCt对照组，并用SPSS 19.0软件单因素方差分析中的Duncan′s多重比较对表达量结果进行差异比较。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测

研究表明，扩增出来的片段是109 bp，与预期的大小相同，无非特异性扩增的条带，反应体系合理，反转录的cDNA可以用于后续的试验。图1

注：M：DL2000 DNA Marker；1-4：WNT2基因

2.2 实时荧光定量PCR检测

研究表明，WNT2基因与GAPDH基因有且只有一个峰，WNT2基因的熔解温度为84℃，GAPDH基因的熔解温度为84.5℃，引物特异性强。图2，图3

图2 WNT2基因的扩增曲线(A)、熔解曲线(B)及熔解峰(C)Fig.2 Amplification Curve(A), Melting Curve(B) and Melting Peak(C) of WNT2 Gene

图3 GAPDH基因的扩增曲线(D)、熔解曲线(E)及熔解(F)Fig.3 Amplification Curve(D), Melting Curve(E) and Melting Peak(F) of GAPDH Gene

2.3 WNT2基因在胚胎期135 d不同组织中的表达

研究表明，皮肤的ΔCt值最小，将皮肤作为对照组进行表达量的计算。WNT2基因在各组织中均有表达，但表达量各不相同。WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著的高于其他6个组织(P<0.01)，且WNT2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉6个组织之间表达差异不显著(P>0.05)。图4

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)

2.4 转录因子的预测

通过使用在线软件PROMO对绵羊WNT2基因启动子区域序列进行转录因子的预测分析，并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化，研究表明，共预测出101个与绵羊WNT2基因相关的转录因子。这些转录因子与WNT2基因存在一定的调节关系，可能是正向调控，也可能是负向调控。图5

图5 WNT2基因启动子区域转录因子Fig.5 Transcription factors in the promoter region of WNT2 gene

图6 核苷酸组成成分Fig.6 Nucleotide composition

2.5 绵羊WNT2基因启动子区域序列核苷酸组成成分

通过使用MEGA 7.0软件分析了WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分，研究表明，WNT2基因启动子区域序列的4种碱基的所占比例大致相同，T为25.90%，C为24.90%，A为25.80%，G为23.30%。图6

2.6 绵羊WNT2基因启动子区域序列密码子偏好性分析

研究表明，共有667个密码子在绵羊WNT2基因启动子区域，而编码氨基酸的密码子有644个。其中，AAA的数量最多，共有26个，占总密码子的3.9%；而CGU的数量最少，有2个，占总密码子的0.3%。RSCU值说明了同义密码子的相对使用度，AUG与UGG的RSCU值为1，这两个密码子的使用不存在偏好性；CAG与UCU的RSCU值相对其他密码子较大，分别为1.42和1.40，说明这两个密码子是使用相对较多的密码子；而CCG与CGU的RSCU值相对其他密码子较小，分别为0.41和0.23，这两个密码子是使用相对较少的密码子。通过对密码子的数量及RSCU值的分析发现，密码子数量与使用偏好性不存在直接的关系。表2

研究表明，667个密码子决定了20种氨基酸，而每一种氨基酸的所占比例各不相同。丝氨酸的由73个密码子决定，而甲硫氨酸仅由5个密码子决定。图7

图7 密码子决定氨基酸种类Fig.7 Types of amino acids determined by codons

2.7 系统进化树

通过使用MEGA 7.0软件构建了绵羊、山羊、牛、人、马、猪、恒河猴、北白颊长臂猿、苏门答腊猩猩、家鼠与兔等11个物种的WNT2基因的DNA序列系统进化树，由研究表明，家鼠和兔与其他9个物种进化距离较远，而这9个物种聚为了2个大的分支，绵羊、山羊、牛、马、猪聚在一个大的进化分支，而人、恒河猴、北白颊长臂猿、苏门答腊猩猩聚在另一个大的进化分支。图8

图8 WNT2基因的系统进化树Fig.8 Phylogenetic Tree of WNT2 Gene

表2 绵羊WNT2基因启动子区域序列密码子偏好性Table 2 Codon preference in the promoter region of sheep WNT2 gene

3 讨 论

WNT信号通路参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等过程，以及邻近细胞间的相互作用[12-13]。一些研究表明，WNT信号通路广泛参与毛囊形态发生的各个环节[14]，该通路对所有类型毛囊形态发生都是非常重要[15]，尤其在毛囊发生的起始阶段起到至关重要的作用[16]。根据以往的研究，已知毛发的生长发育受毛囊周期变化的调节[17]。WNT信号通路中的WNT2在毛囊形态发生中起到重要作用，调节毛发长度[18]。

研究采用qRT-PCR法对苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达进行研究，结果发现WNT2基因在7个组织中均有表达，而在皮肤组织中的表达量极显著的高于其他6个组织(P<0.01)。已有报道证明WNT2基因在山羊各组织中均有表达，但在胚胎期90 d时，WNT2基因在肺脏中的表达量高于皮肤，而在心脏、肝脏及肾脏的表达量低于皮肤[19]，与研究结果部分一致。可能是WNT2基因在不同品种羊皮肤组织中的表达量不同，也有可能是研究时期不同造成表达量不同。冯新宇[20]表明WNT2基因的表达下调会激活凋亡通路，造成细胞凋亡，进一步说明WNT2基因对毛囊的生长发育具有促进作用。

转录因子通过与启动子上特定的DNA序列结合以激活或抑制特定基因的表达，研究通过对绵羊WNT2基因启动子区域序列的转录因子预测，共预测出101个相关转录因子，与WNT2基因存在或正或负的调节关系，但具体调控作用有待进一步研究。通过对绵羊WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分分析发现，4种碱基呈现均匀分布。对密码子偏好性分布分析发现，CAG与UCU是使用相对较多的密码子，而启动子区域的丝氨酸，由73个密码子决定。在不同物种之间构建系统发育树以揭示绵羊WNT2基因的系统发育关系，发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他动物进行比较时更为接近，这与薛丽娜等[21]的研究结果一致。

miRNA是转录后基因表达的重要调节因子，也可能是表型调控的潜在位点[22]。一些miRNA在细胞分化和皮肤毛囊的增殖中起着关键作用，它们的靶基因在毛囊的周期性生长中起着重要作用。Chen Y等[23]表明miRNA对WNT2基因表达的调节可能依赖于转录降解，miR-125a通过影响WNT信号通路中基因的mRNA表达水平参与毛囊发育，如WNT2、β-连环蛋白1 (Catenin beta 1,CTNNB1)、淋巴增强子结合因子1 (Lymphoid Enhancer Binding Factor 1,LEF-1)及过氧化物酶体增殖物激活受体δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta,PPARD)。WNT基因家族编码大量分泌蛋白，作为信号蛋白在细胞间传递，使细胞分化。而研究结果表明WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d的表达量最高，说明WNT2基因编码的WNT2蛋白可能在绵羊皮肤组织中大量存在。

4 结 论

WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子，4种碱基呈现均匀分布，CAG与UCU的是使用相对较多的密码子，对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他动物进行比较时更为接近。