拱棚覆网对喀什地区复播甜瓜病毒病的防治效果

毛建才，王豪杰，李俊华，翟文强

(新疆农业科学院哈密瓜研究中心，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】喀什地区光热资源丰富，平原地区平均无霜期215 d，小麦收割后适合复播甜瓜生产。传统上复播甜瓜在6月底到7月上旬播种，9月底到10月上旬采收，果实不仅品质好且非常耐贮。由于复播甜瓜的销售价格高于正播甜瓜(7月下旬到8月上旬上市)2～4倍。但近年由于病毒病危害，常规方法已无法种植复播甜瓜，研究通过改进栽培模式，研究喀什地区复播甜瓜病毒病的防疫，对甜瓜抗病育种有实际意义。【前人研究进展】关于新疆甜瓜病毒病的报道仅限于正播甜瓜，对于复播甜瓜病毒病的种类及优势病毒尚没有报道。到目前为止，引起正播甜瓜病毒病的主要是黄瓜花叶病毒(CMV)、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦花叶病毒(ZYMV)[1-3]，引起复播甜瓜病毒病的种类还有待确定。【本研究切入点】病毒病是影响复播甜瓜最重要的病害，通过覆盖防虫网防治复播甜瓜病毒病的方法未见报道，研究该种栽培方式下的甜瓜产量、品质、商品率等，评价其生产应用的可行性及应用前景。通过小拱棚覆盖防虫网能够隔绝传毒媒介昆虫的传毒，降低复播甜瓜病毒病的发生率。但此种方法对复播甜瓜病毒病的防治效果以及对甜瓜坐果、产量和品质的影响需要明确。研究揭去防虫网后，既能达到防治病毒病的最大化，又影响甜瓜正常授粉，并达到坐果率及果品质量最优化。【拟解决的关键问题】研究不同时期揭去防虫网甜瓜的产量、品质和商品率，分析最佳揭网时间，确定该种栽培模式的可行性及应用前景和引起喀什地区复播甜瓜病毒病种类，对选择的材料进行抗病性筛选，为生产和抗病育种研究打基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

毒源按各病毒病发病时期采自新疆喀什各个地区，之后迅速置于液氮中冷冻保存备用。RNA提取试剂盒，DNA纯化、回收试剂盒购自天根生物公司，HIFIScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自康为世纪公司，其他常规试剂均购自北京全式金公司，大肠杆菌DH5α由本试验室保存，氨苄霉素(Amp)的使用浓度为100 μg/mL。表1

防虫网罩(60目)购自喀什，复播甜瓜试验品种(系)“金秀”、温室抗病性鉴定材料均由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供，田间试验在新疆农业科学院哈密瓜研究中心疏勒研究示范基地进行。

表 1 供试材料及来源Table 1 Information of the test materials

1.2 方 法

1.2.1 拱棚覆网栽培模式

甜瓜简约化栽模式参照王豪杰等[4]的进行，播种后立即搭建拱棚覆盖防虫网。

1.2.2 撤防虫网最佳时间确定1.2.2.1 病情指数调查

采用随机区组试验，将试验地分为4个小区，命名为1、2、3、4号小区，每个小区设置三个重复，6月25号播种，之后覆盖防虫网，以不覆盖防虫网的小区作为对照。分别于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去第1、2、3、4号小区的防虫网。撤去防虫网一周后逐日观察症状，30 d后记录症状等级，分级标准参照陈洁云等[6]等的方法进行，统计每个重复的病情指数。

1.2.2.2 果品质量参数统计

中心折光糖度测定用电子测糖仪测量，每个小区随机选取5个单瓜测量；产量的统计方式是从每个小区随机选取20个单瓜称重，取平均值折合成单位面积产量。平均单株结果数、商品率的计算方式参照王豪杰等[4]的方法进行。

1.2.3 甜瓜病毒总RNA的提取

将样品置于液氮中迅速研磨成粉状，装100 mg左右的组织加入1 mL TRizol，200 μL氯仿，在室温中放置5 min，使核酸和蛋白质完全分离，之后置于4℃离心机中，12 000 r/min离心10 min。吸取上清，加入600 μL氯仿、200 μL无水乙醇，12 000 r/min离心10 min。吸取上清，加入等量的异丙醇，颠倒混匀，在冰上放置10 min，继续离心10 min，弃去上清液，沉淀用1mL的乙醇(Φ=75%)洗涤2次，置于室温中干燥，用适量的DEPC水溶解，检测纯度和浓度后，分装保存于-80℃冰箱中备用。

1.2.4 病毒 cDNA第一链合成

病毒cDNA第一链的合成采用康为实际公司的反转录试剂盒进行。向DEPC水处理过的PCR管中1 μg总RNA，1 μL gDNA Eraser Buffer，0.5 μL gDNA Eraser，用无核酸酶的纯水补充至10 μL，混合均匀，短暂离心后在42℃水浴锅中反应2 min。反应结束后，短暂离心置于冰上冷却。之后再加入1 μL HiFiScript，1 μL Primer Mix，4 μL反应Buffer，4 μL无核酸酶的高纯水，混合均匀，短暂离心后置于42℃水浴锅中反应15 min，85℃反应5 min终止反应。将cDNA分装后置于-20℃保存备用。

1.2.5 引物设计

PCR引物参照李继洋[1]等的设计，由北京六合华大基因公司合成。表2

表2 甜瓜3种病毒PCR反应引物Table 2 Primer information for PCR reaction of three virus in melon

1.2.6 病毒RT-PCR检测

随机选取15个供试样品，提取总RNA并合成cDNA第一链，用于RT-PCR检测。反应体系(25 μL)包括：2.5 μL 10×Buffer(含MgCl2)，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1、0.5 μLTaqDNA聚合酶，1 μL模板cDNA，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为：30 × (94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，最后，72℃ 10 min。产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。

1.2.7 病毒PCR产物的纯化与连接

将凝胶中与GenBank中比对的WMV、CMV、ZYMV CP蛋白基因片段预测大小相近的扩增产物条带进行切胶回收。利用琼脂糖DNA回收试剂盒(DP209-03)进行纯化。具体方法参照试剂盒使用说明。将切下的胶块称重，加入等倍体积溶胶液，50℃水浴放置，待胶块完全溶解之后，将所得溶液加入吸附柱中，室温放置2 min，之后12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液；用600 μL漂洗液漂洗2次，弃废液，12 000 r/min离心2 min，室温干燥。将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2 min，之后置于离心机12 000 r/min离心2 min，得到回收片段。

将回收片段连接到pMD18-T载体上(具体方法参照试剂盒使用说明)，利用热击转化技术转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃暗培养12 h。挑取单菌落于LB(含有Amp)培养基中37℃、200 r/min振荡培养。进行菌液PCR 扩增，检测得到阳性克隆并送往公司测序(北京六合华大基因有限公司)。

1.2.8 抗病性鉴定

室内进行品种抗病性测定。选取本单位的10个材料，经过表面消毒后在营养钵中种植，每个材料设置3个重复，每个重复接种30 株幼苗。所用的土壤事先高温高压灭菌处理。待幼苗长出两片真叶时选择生长一致的健康植株，采用汁液摩擦接种法进行病毒接种[5]。将接种的幼苗置于防虫温室中，温度控制在21 ～ 28℃。接种5 d后逐日观察症状，接种30 d待病情稳定后，统计病情指数，初步评估这几个品种的抗病性。

根据甜瓜病毒病症状特定，参照陈洁云[5]制定以下分级标准：

0，无明显症状；1，叶片轻花叶或轻度卷叶；2，重花叶或植株轻度矮化；3，严重疱斑花叶伴随畸形，植株无明显矮化；4，叶片明显缩小伴重度畸形花叶，植株明显矮化。

病情指数(DI)=100×∑(病害的级数×该级病害株数/病害的最高级×样本总数)。

2 结果与分析

2.1 撤防虫网最佳时间

2.1.1 病情指数

分别于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各处理小区的防虫网。5 d后逐日观察症状，30 d后统计对照和4个处理小区的病情指数， 结果显示对照的病情指数是83.64，4个处理小区的病情指数分别是53.82、37.25、24.25和21.07，各个处理与对照之间的差异极显著，小拱棚覆盖防虫网对减轻复播甜瓜病毒病的发生有显著的效果。图1

M：对照小区(Mock)；1：7月20日撤去防虫网；2：7月25日撤去防虫网；3：8月1日撤去防虫网；4：8月5日撤去防虫网

2.1.2 产量

平均单株结果数是构成产量的主要因素，而病毒病是影响复播甜瓜单株结果数和产量的主要原因，不同时期撤去防虫网后的病情指数有差异，虫媒雌花授粉率也各不相同，导致单株平均结果数与产量也不同。

在7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各处理小区的防虫网，收获前统计各小区的平均单株结果数和产量。结果显示，没有覆盖防虫网的对照小区，平均单株结果数为0.4个，几乎绝收，其他处理的4个小区平均单株结果数分别为2.3、2.5、3.1和2.2个。在8月1日揭去防虫网复播甜瓜产量最高。图2

注：A：平均单株结果数；B产量；M：对照小区(Mock)；1：7月20日撤去防虫网；2：7月25日撤去防虫网；3：8月1日撤去防虫网；4：8月5日撤去防虫网

2.1.3 品质和商品率

研究表明，对照的平均含糖量为10.9，4个处理小区的平均含糖量依次为15.9、15.7、15.8和15.3，各个处理之间的差异不显著。覆盖防虫网有效的减轻了病毒病的危害，保证了复播甜瓜的品质，满足商品瓜的含糖量要求。图2

复播甜瓜肥水管理等方面做的比较精细，在将病毒病控制好的前提下，商品率能达到较高水平。试验田对照的商品率为8.9%，4个处理小区的商品率分别为70.8%、71.5%、79.3%和76.9%，在8月1日揭去防虫网，商品率最高。图3

注：A：中心折光含糖量；B商品率；M：对照小区(Mock)；1：7月20日撤去防虫网；2：7月25日撤去防虫网；3：8月1日撤去防虫网；4：8月5日撤去防虫网

应用 WMV、ZYMV 和CMV特异性引物分别检测伽师县、麦盖提县、疏勒县、疏附这四个地区收集到的畸形、花叶型和黄化型病毒病样。经过1%的琼脂糖凝胶电泳后，CMV特异性引物经反应，扩增得到476 bp的特异性条带(图4A)；WMV扩增得到1 000 bp的特异性条带(图4B)；ZYMV扩增得到1 100 bp的特异性条带(图4C)。通过回收、测序，在GENBANK上进行比对，这三个地区所采集到的样品均能检测到WMV、ZYMV 和CMV三种病毒，这与夏季正播甜瓜的病原是一致的，且多为复合侵染。图4

2.2 不同甜瓜品种的抗病性鉴定

在接种一周后逐渐观察，接种30 d后，发病的植株出现典型的黄化、花叶、植株矮化等症状，统计病情指数。抗病性鉴定结果显示，所有供试品种中，黄皮9818的病情指数最高，是71.39，K-1的病情指数最低，是7.22，达到了耐病的水平。所有的对照处理植株均表现健康。表3

注:A：黄瓜花叶病毒(CMV)鉴定结果；B：西瓜花叶病毒(WMV)鉴定结果；C：小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)鉴定结果；M：DL-2000 marker；—：阴性对照

表3 不同甜瓜品种抗病性鉴定结果Table 3 Resistance test for various melon cultivars against melon virus

3 讨 论

甜瓜生产在喀什地区的农村经济发展和农民脱贫增收中具有重要的作用，是极有区域优势的重大特色产业[6]。喀什地区有着独特的气候条件和丰富的光热资源，小麦收割后种植复播甜瓜是一种积极而有效的选择，对延长甜瓜市场供应期、促进农民脱贫增收有很重要的现实意义。病毒病是影响复播甜瓜生产最主要的病害，严重影响产量和品质[6-9]。病毒是分子病原物，目前尚无有效的防治方法和防治药剂，一旦流行，就会造成较为严重的为害[10]，对于复播甜瓜极大可能造成绝收。昆虫是甜瓜病毒病传播最有效的媒介，7月是喀什地区蚜虫、粉虱等媒介昆虫的主要传毒期，也是复播甜瓜开花结果的关键时期。覆盖防虫网能有效隔绝传毒媒介昆虫的传毒，极大程度上降低复播甜瓜病毒病的发生率，但对甜瓜结果会造成影响(虫媒雌花不能授粉)。该报道对何时撤去防虫网既能达到防止病毒病的最大化，也不影响甜瓜正常授粉，达到坐果率及果品质量的最优化展开研究。

据文献报道，在全世界范围内为害葫芦科作物的主要病毒为 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV[10-20]。 关于新疆地区的甜瓜病毒病也有报道[1]，但限于正播品种，对复播甜瓜的病毒病及优势病毒尚没有报道。研究采用RT-PCR对喀什地区几个复播甜瓜主产区(伽师、麦盖提、疏勒)的病毒病进行分子生物学鉴定，明确了复播甜瓜病毒病的种类与正播甜瓜的种类一致。

近年来调研发现，目前在南疆主栽的甜瓜品种对病毒病都比较敏感，很难发现对病毒病有良好抗性的品种。因此，研究中除选用了南、北疆一些常见的甜瓜商业品种，还选用几个新品系进行抗病性鉴定。这些鉴别寄主虽然没有在大田中大面积栽培，但其很可能存在对病毒有良好抗性的抗病基因[21]。抗病性鉴定结果表明，编号K-1的材料的病情指数仅为7.22，在温室大棚种植也有较好的抗性，其抗病机理和相关抗性基因的挖掘有待进一步研究。

4 结 论

小拱棚覆盖防虫网能有效防治喀什地区复播甜瓜病毒病的传播与流行，技术可行，前景广阔。在8月1号前后撤去防虫网，既能达到病毒防治效果的最大化，也不影响复播甜瓜的授粉和坐果，达到坐果率及果品质量的最优化。喀什地区晚秋复播甜瓜病毒病的种类是WMV、ZYMV 和CMV，且多为复合侵染，这与侵染正播甜瓜病毒病的种类相一致。新疆主栽的甜瓜品种对病毒病都比较敏感，仅K-1在抗病性鉴定中表现良好，在温室大棚中也有较好的抗性。