羊骨胶原肽对去卵巢大鼠的骨质改善作用

原恺，李爱玲，韩克光，郝在林，程稚玲，陈静，金淑秀，马林峰，霍乃蕊*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.古县畜牧兽医局，山西 古县 042400；3.锡林郭勒盟肽好生物制品有限责任公司，内蒙古 锡林郭勒 026000；4.山西农业大学 食品与工程学院，山西 太谷 030801)

绝经妇女因雌激素水平下降易导致骨代谢失衡，进而引起骨质疏松症(osteoporosis，OP)，OP是一种以骨量降低、骨矿物质比例减少、骨微观结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易骨折的全身性疾病[1,2]。OP引起的骨折等并发症严重影响着中老年妇女的健康，而目前传统治疗OP的方法多为药物治疗，如雌激素，双磷酸盐类等，副作用明显[3]。因此，研发安全有效的新型OP非药物防治制剂非常有必要。

我国的畜禽骨资源丰富，而且骨的营养成分很多[4]。畜骨提取的胶原蛋白中存在很多有生物活性的小分子肽段，且更易被吸收，有研究显示骨酶解得到的骨胶原肽可能对骨代谢的调节有一定作用[5]。本实验室前期已经通过酶解羊骨成功制备了羊骨胶原肽(collagen peptide，CP)，并证实了CP对骨代谢的调节作用[6,7]，但对于羊骨胶原肽对雌激素缺乏导致的疏松骨质的效果尚未研究。

临床上能反映骨质情况的指标包括骨密度、骨矿物质及骨有机质含量[8～10]，血清中PINP和β-CTx是骨代谢标志物，其水平能客观反应骨代谢情况[11]。而目前对于OP的研究大多采用成年雌性大鼠双侧卵巢摘除的骨质疏松模型[12]。因此，本研究通过构建去卵巢大鼠骨质疏松模型，并检测CP对去卵巢大鼠骨密度，骨矿物质及骨有机质含量以及血清中PINP和β-CTx的水平的影响，探讨CP对去卵巢大鼠疏松骨质的作用，为人和动物OP的防治提供新的、更加安全有效的制剂以及为畜骨资源的高值利用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

CP购于内蒙古锡林郭勒盟肽好生物制品有限责任公司。17β-雌二醇购于北京索莱宝科技有限公司，PINP、β-CTx酶联免疫吸附试剂盒购于伊莱瑞特生物科技有限公司，羟脯氨酸试剂盒购于南京建成生物工程研究所。乙醚、生理盐水、无水乙醇等均为分析纯。

火焰原子吸收分光光度计(WDF-Y2，英国Stevens公司)，箱式电阻炉(SX-12-10，上海实验电炉厂)，多功能酶标仪(SPectraMax M5，Molecular Devices公司)。

1.2 试验试验动物与分组处理

选取体重(203±20)g的10周龄雌性SD大鼠48只。大鼠和基础饲料由山西医科大学动物实验中心【SCXK(晋)2015-0001】提供。适应性喂养2周后，随机取40只大鼠手术切除双侧卵巢，剩余大鼠做为假手术组(SHAM)切除卵巢附近等重量的脂肪，其中切卵巢大鼠中随机取8只作为模型组(OVX)。手术后大鼠，给予正常进食和饮水，在(23±2)℃下，适应性喂养1周后，SHAM组与OVX组正常喂食。剩余切卵巢大鼠随机分组(n=8)：羊骨胶原肽的高中低剂量组(CP-H、CP-M、CP-L)每天分别灌胃CP(3.4，2.05，0.68 g·kg-1)，以上处理9周后处死大鼠。上述所有动物操作均根据“中华人民共和国实验动物管理和使用指南”进行，试验试验方案经动物科学与兽医学院伦理与福利委员会批准。

1.3 骨密度、骨矿物质及羟脯氨酸含量的测定

大鼠处死后，剥离双侧股骨，剔除杂肉后称重(M)，用排水法测定体积(V)，按M/V计算骨密度。再测定其中的骨矿物质和羟脯氨酸含量：取大鼠左侧股骨，称重，磨碎，进行灰化，时间为2 h。取出骨灰，用硝酸溶解，经处理后用火焰原子吸收分光光度计来进行Ca、Mg、Mn、Zn的测定[13]。羟脯氨酸含量的测定参考南京建成羟脯氨酸测试盒说明书。

1.4 血液PINP及β-CTx水平测定

采用双抗体夹心的ELISA法测定血液中PINP，将标准品(浓度为4 000 pg·mL-1)进行倍比稀释，稀释浓度分别为：4 000、2 000、1 000、500、250、62.5、0 pg·mL-1，在450 nm下，测定标准品各稀释浓度对应的OD450值。以标准品大鼠PINP浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制标准曲线，同时得到标准曲线的拟合方程。标准曲线绘制完成后，取分装的血清样品，参照ELISA试剂盒的使用说明，测得对应的OD450值，根据测得的OD450值和标准曲线的拟合方程，计算实际样品中的PINP浓度。

采用竞争ELISA法测定血液中β-CTx，参照试剂盒的操作说明进行测定，首先以大鼠标准品β-CTx系列浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，制作标准曲线，取分装的血清样品进行测定，根据OD450值和标准曲线的拟合方程，计算实际样品中的β-CTx浓度。

1.5 统计分析方法

2 结果与分析

2.1 CP对去卵巢大鼠股骨密度的影响

由图1可见，OVX组大鼠股骨密度显著低于SHAM组，证明大鼠去卵巢后股骨密度显著降低，去卵巢大鼠骨质疏松模型建立成功。CP各剂量组及E2组大鼠股骨密度显著高于OVX组，但均显著低于SHAM组，其中CP中剂量组股骨密度显著高于低剂量组和高剂量组(P<0.05)，表明CP可以抑制去卵巢大鼠股骨密度的降低。

图1 CP对去卵巢大鼠股骨密度的影响Fig.1 Effect of CP on femur density in ovariectomized rats注：不同字母代表差异显著(P<0.05)。下同。Note:Different letters show significant difference at the 0.05 level.The same below.

2.2 CP对去卵巢大鼠骨矿物质含量的影响

由图2可以看出，OVX组大鼠骨矿物质Ca、Mg、Zn、Mn的含量均显著低于SHAM组(P<0.05)，表明大鼠去除卵巢后股骨矿物质的含量显著流失；而CP各剂量组与E2组大鼠骨矿物质含量均显著高于OVX组(P<0.05)，因此CP可以有效抑制去卵巢大鼠骨矿物质的流失。

2.3 CP对去卵巢大鼠股骨中羟脯氨酸含量的影响

由图3可知，OVX组大鼠股骨中羟脯氨酸含量显著低于SHAM组，大鼠去除卵巢后骨有机质羟脯氨酸含量显著降低，CP各剂量组与E2组大鼠股骨中羟脯氨酸含量显著高于OVX组，CP各剂量组中CP-M组的羟脯氨酸含量最高(P<0.05)，因此CP可以有效抑制羟脯氨酸的流失。

2.4 CP对去卵巢大鼠血清PINP和β-CTx水平的影响

以标准品稀释浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，绘制的标准曲线如图4所示。

标准曲线的拟合方程分别为：

yPINP=3.242(1-exp(-0.001x)；

yβ-CTx=(0.275+0.002x)^(-1/1.711)。

根据上述拟合方程，计算各组大鼠血清中PINP和β-CTx的含量，由表1可知，OVX组大鼠血清中的PINP和β-CTx含量均显著高于SHAM组，CP各剂量组与E2组大鼠血清中的PINP和β-CTx含量均显著低于OVX组(P<0.05)且CP-L组与SHAM组差异不显著(P>0.05)。因此CP可以有效降低去卵巢大鼠血清中PINP和β-CTx含量。

3 讨论与结论

雌激素是维持骨代谢平衡的重要因素[14]，大鼠切除卵巢后，体内雌激素水平降低，骨吸收大于骨形成，进而导致OP的发生。因此常用切除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松模型。目前临床上以骨密度减少作为判断OP发生的主要标准[15]。PINP为I型前胶原氨基端前肽，β-CTx为I型胶原分解的产物，OP发生时，骨代谢加快，骨转换活跃，血清中PINP和β-CTx的含量升高[16]。本研究发现，大鼠在去卵巢9周后，OVX组大鼠股骨密度显著低于SHAM组，血清PINP及β-CTx水平显著高于SHAM组(P<0.05)，此结果与董培智、蒋宜伟等[17,18]的研究结果相同，说明本研究选用10周龄大鼠去卵巢骨质疏松模型建立成功。

图2 CP对去卵巢大鼠股骨矿物质(Ca、Mg、Zn、Mn)含量的影响Fig.2 Effect of CP on the contents of femur minerals (Ca, Mg, Zn, Mn) in ovariectomized rats

图3 CP对去卵巢大鼠股骨羟脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of CP on the content of hydroxyproline in femur of ovariectomized rats

骨密度是分析骨代谢变化的重要内容，通过测量骨密度可了解骨吸收与骨形成的状态，评价骨骼的脆性[15]。本研究通过对各组的大鼠股骨密度的检测发现，CP各剂量组大鼠股骨密度均显著高于OVX组，其中CP-M组大鼠股骨密度在药物剂量组中最高，但达不到SHAM组水平(P<0.05)，此结果与韩龙等[19]的研究结果相似，说明CP可以在一定程度上提高去卵巢大鼠的股骨密度，但无法恢复到正常状态。

图4 大鼠PINP(左)及β-CTx(右)标准曲线Fig.4 Standard curves of PINP and β-CTx

表1各组大鼠血清中PINP和β-CTx的含量(n=8)

Table1 Concentrations of PINP and β-CTx in rat serums

分组GroupsPINP/pg·mL-1β-CTx/pg·mL-1SHAM组2 258.55±140.87d370.98±61.89cOVX组3 528.37±154.74a529.67±23.63aE22 877.19±233.87bc416.042±42.56bcCP-H3 313.34±189.46b488.80±33.92abCP-M2 694.52±311.45c483.79±78.06abCP-L2 536.42±231.07cd398.36±79.43bc

骨的矿物质成分提供了骨的硬度和刚度，而骨有机质中的主要成分—骨胶原能够保持骨骼的韧性[20]。骨的矿物质中Ca、Mg、Mn和Zn的含量对骨量影响较大，Ca是骨组织的主要元素，Ca的流失会导致OP；Mn摄入不足会抑制成骨细胞活性，进而引起OP；Mg是骨生长中的必需元素；缺Zn则会导致骨代谢紊乱，骨形态结构异常[21]。羟脯氨酸是骨胶原组织的主要成分之一，其含量能直接反应骨代谢情况，当其含量降低时，往往预示着OP的发生[22]。

本研究中，OVX组大鼠股骨中骨矿物质(Ca、Mg、Mn、Zn)含量及羟脯氨酸含量均显著低于SHAM组，而CP各组去卵巢大鼠股骨中骨矿物质(Ca、Mg、Mn、Zn)含量及羟脯氨酸含量均显著高于OVX组(P<0.05)，与那晓琳等[23]研究结果相同，说明CP能有效抑制去卵巢大鼠骨矿物质与骨有机质的流失。

血清中PINP和β-CTx是国际骨质疏松基金会(International Osteoporosis Foundation，IOF)推荐的骨代谢标志指标[13]。本研究结果显示CP各剂量组的大鼠血清PINP及β-CTx水平显著低于OVX组(P<0.05)，与蒋宜伟[18]等的研究结果相同，表明CP可以降低血清中骨代谢标志物的水平，进而降低骨转换效率，但其具体机制还需进一步研究。

综上所述，羊骨胶原肽可以通过提高去卵巢大鼠的骨密度，抑制骨矿物质与骨有机质的流失，降低血清中骨代谢标志物水平，从而改善去卵巢大鼠的疏松骨质。