三草素抗炎作用的机制研究

李丽珍，陈嘉炫

（1.福建医科大学附属龙岩市第一医院，福建 龙岩 364000；2.福建中医药大学附属龙岩人民医院，福建 龙岩 364000）

感染性疾病是临床的常见病和多发病。随着抗生素新品种的日益增加，临床应用越来越广泛，其滥用和不合理用药现象时常发生，造成严重的不良反应和耐药菌株的产生，给临床治疗带来困难，也给患者增加经济负担。世界卫生组织（WHO）的专家指出：“抗生素的耐药问题成为一个全球性的公共健康问题，最令人担心的是多重耐药性的上升，减少抗生素的不合理应用是控制抗生素耐药性的最重要的措施之一”［1］。此外，从传统中草药中寻找抗炎、抗菌的中草药制成安全有效的制剂也是今后的研究方向。三草素是筋骨草、鱼腥草、草珊瑚的黄酮类化合物。根据筋骨草、鱼腥草、草珊瑚民间和传统应用经验，结合现代对其有效成分、药理作用的研究成果，本研究通过三草素含药血清对经脂多糖（lipopolys-accharide，LPS）诱导 RAW264.7 巨噬细胞的影响，初步研究三草素抗炎作用的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级SD种大鼠50只，体质量180～220 g，雌雄各半，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号（2007000536576）。实验和饲养环境温度（22±1）℃，湿度40%～70%。明暗各12 h，早上9点投食，定期紫外线消毒，每日更换饮水及饲料，保持动物生活环境通风及清洁卫生。

1.2 实验细胞株 RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞购自武汉博士德生物工程有限公司，货号：CX0260。

1.3 实验药物 三草素（福建中医药大学药用植物资源科研室提供）；醋酸泼尼松（浙江仙琚制药股份有限公司，生产批号：120336）。

1.4 实验试剂 戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20020405）；胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM高糖培养基、1%青链霉素合剂、0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、脂多糖（美国Sigma公司）；75%乙醇消毒液（江西健宝医药科技有限公司，批号：20120216）；LTB4 试剂盒（上海联硕生物科技有限公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.5 实验仪器 TGL-16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；Bio-Rad Mode lm680酶标仪（美国Gene公司）；H-1600RW台式高速离心机（德国Hettich公司）；洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；超低温冰箱、恒温水浴锅、CO2培养箱（日本Sanyo公司）。

2 方 法

2.1 三草素含药血清的制备 将清洁级SD大鼠随机分为空白组，阳性组，三草素低、中、高剂量组。阳性组按0.015 g／（kg·d）予醋酸泼尼松药液灌胃，三草素高、中、低剂量组分别按 6、3、1.5 g／（kg·d）予三草素药液灌胃，空白组予等量饮用水灌胃。每日灌胃2次，连续干预3 d，末次给药2 h后腹主动脉取血，3 000 r／min 离心 20 min，取上层血清，56 ℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装后－20℃保存备用。

2.2 细胞培养 用0.25%的胰蛋白酶消化处于生长对数期的单层培养细胞，终止消化，1 000 r／min离心5 min，弃上清液后加入完全培养基（90%DMEM高糖培养基，10%FBS、1%双抗）制成细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为105个／mL，接种于96孔板上，每孔加200 μL细胞悬液。将96孔板放入培养箱（37 ℃、5%CO2、饱和湿度）中培养 24 h。

2.3 含药血清对RAW264.7细胞增殖的影响 分组：空白对照组、空白血清组、阳性血清组、低剂量三草素血清组、中剂量三草素血清组、高剂量三草素血清组。空白对照组加入完全培养基，余下各组加入含10%相应大鼠血清的DMEM高糖培养基，培养24 h后，弃培养液，每孔加入10 μL 0.5 mg／mL的MTT液及90 μL无血清DMEM培养液，置培养箱中培养4 h后，弃上清液，加入 100 μL DMSO，摇匀。使用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔吸光度A值，记录结果。

2.4 含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖的影响 分组：空白对照组、空白血清组、模型组、阳性血清组、低剂量三草素血清组、中剂量三草素血清组、高剂量三草素血清组。空白对照组加入完全培养基，模型组加入含10%空白血清的DMEM高糖培养基，余下各组加入含10%相应大鼠血清的DMEM高糖培养基，培养4 h后，除空白对照组和空白血清组外，其他各组加入终浓度为100 ng／mL的LPS进行诱导，置培养箱培养20 h。应用MTT法检测各组各孔吸光度A值，记录结果。按照公式计算细胞相对抑制率［2］。

细胞相对抑制率／%＝（1－含药血清组A值均值／模型组A值均值）×100%

2.5 含药血清对LTB4的生成及炎症细胞因子的影响 分组：空白血清组、模型组、阳性血清组、低剂量三草素血清组、中剂量三草素血清组、高剂量三草素血清组。空白对照组加入完全培养基，模型组加入含10%空白血清的DMEM高糖培养基，余下各组加入含10%相应大鼠血清的DMEM高糖培养基，培养4 h后，除空白血清组外，其他各组加入终浓度为100 ng／mL的LPS进行诱导，置培养箱培养20 h。干预后将96孔板予3 000 r／min离心5 min，收集上清液。根据试剂盒操作程序检测上清液中LTB4、IL-1β、IL-6、TNF-α 浓度。

2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布以（）表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。

3 结 果

3.1 三草素含药血清对RAW264.7细胞增殖的影响 说明各给药剂量组具有促进RAW264.7细胞增殖的活性，无细胞毒性，对RAW264.7细胞的生存没有影响。结果见表1。

表1 三草素含药血清对RAW264.7细胞增殖的影响（）

表1 三草素含药血清对RAW264.7细胞增殖的影响（）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05。

组别空白对照组空白血清组阳性血清组低剂量三草素血清组中剂量三草素血清组高剂量三草素血清组n 6 6 6 6 6 6 A值0.261±0.015 0.416±0.0471）0.465±0.0351）0.456±0.0801）0.470±0.0731）0.435±0.0441）

3.2 含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖的影响 RAW264.7细胞经LPS诱导后，促进细胞生长活性，细胞增殖迅速。高、中、低剂量血清组和阳性血清组具有抑制经LPS刺激的RAW264.7细胞的生长活性，抑制RAW264.7细胞的增殖。结果见表2。

表2 三草素含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖的影响（）

表2 三草素含药血清对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖的影响（）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05；与空白血清组比较，2）P＜0.05；与模型组比较，3） P＜0.05。

组别空白对照组空白血清组模型组阳性血清组低剂量三草素血清组中剂量三草素血清组高剂量三草素血清组n 6 6 6 6 6 6 6 A值 相对抑制率／%0.323±0.019 0.416±0.0471）0.815±0.0972）0.580±0.0703）0.613±0.0703）0.649±0.0633）0.640±0.0453）— —28.8 24.7 20.4 21.5

3.3 含药血清对 IL-1β、IL-6、TNF-α 细胞因子及LTB4的影响 见表3。

表3 含药血清对对IL-1β、IL-6、TNF-α 细胞因子及LTB4的影响（）

表3 含药血清对对IL-1β、IL-6、TNF-α 细胞因子及LTB4的影响（）

注：与空白血清组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白血清组模型组阳性血清组低剂量三草素血清组中剂量三草素血清组高剂量三草素血清组n 6 6 6 6 6 6 IL-1β／（pg／mL）26.96±11.77 103.57±12.671）66.65±28.342）62.21±31.242）65.73±32.822）70.42±20.562）IL-6／（pg／mL）67.90±29.78 621.7±138.71）86.24±28.562）85.76±36.032）82.19±31.722）93.86±53.802）TNF-α／（pg／mL）1268.95±136.12 2951.40±582.91）1196.14±65.772）1388.68±231.42）1338.68±191.22）1607.10±350.82）LTB4／（ng／L）197.44±44.75 258.20±5.351）233.26±18.782）240.84±25.98 244.47±21.71 223.99±27.992）

4 讨 论

巨噬细胞可以通过激活机体的免疫系统，释放脂类介质、细胞因子和活性氧等一系列炎症介质，参与机体的炎症级联反应［3］。研究显示，RAW264.7小鼠单核巨噬细胞可参与机体的免疫过程，特别是机体受到LPS等外界刺激后能够促进体内炎症介质的生成，并且启动机体抵抗炎症系统的功能［4］。因此，本研究采用LPS刺激RAW264.7小鼠单核巨噬细胞建立研究炎症细胞模型。

LTB4可激活中性白细胞的多种反应，包括加速炎症介质产生，促进中性白细胞在微血管内皮粘着，接着渗出血管，其他趋化因子使炎症反应扩大，LTB4在依赖中性白细胞的炎症反应中发挥着一种内在放大器的作用［5］。细胞因子有很多种类，其中IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子等显得较为重要。IL-1β主要是由活化的单核-巨噬细胞产生，可以活化T细胞、促进B细胞的增殖分化。IL-6可以提高内皮细胞的通透性，促进中性粒细胞和内皮细胞间的黏附，可以促进T、B细胞的增殖分化，在B细胞的分化过程中发挥着重要作用。TNF-α是机体的炎症反应与免疫应答的重要调节因子，在内毒素病毒及其他细胞因子刺激下由不同细胞分泌，主要来自单核-巨噬细胞和T淋巴细胞，是强有力的促炎症反应的细胞因子［5］。中草药的抗炎功效一般与抑制炎性细胞因子的产生有关，中草药通过其他途径发挥抗炎功效的同时，还会影响细胞因子，从而发挥共同的抗炎作用［6］。

本研究结果显示，三草素含药血清高剂量血清组降低LPS诱导的RAW264.7细胞LTB4的生成；不同剂量三草素含药血清均可不同程度地降低LPS诱导的 RAW264.7细胞 IL-1β、IL-6和 TNF-α细胞因子的分泌，初步表明三草素可能是通过降低上述炎症介质的分泌而发挥抗炎作用的。